МУ 3.5.2596-10

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.5. ДЕЗИНФЕКТОЛОГИЯ

Методы изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств

     

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ ФГУН "НИИ дезинфектологии" Роспотребнадзора (Л.С.Федорова, И.М.Цвирова); ФГУ "Уральский НИИ фтизиопульмонологии" Росмедтехнологий (В.В.Канищев, Н.И.Еремеева, М.А.Кравченко, Д.В.Вахрушева); Роспотребнадзором (Л.С.Бойко).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Роспотребнадзора (протокол N 3 от 03.12.09).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 29.03.10.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения

Настоящие методические указания предназначены для организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности, осуществляющих разработку, изучение, производство, испытание, государственную регистрацию, сертификацию, применение, а также осуществляющих надзор и производственный контроль за производством и применением дезинфицирующих средств (ДС) и их субстанций (действующих веществ - ДВ), обладающих туберкулоцидной активностью.

2. Общие положения

Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии" [1] регламентирует проведение неспецифической профилактики инфекционных заболеваний. В комплекс неспецифических профилактических мероприятий входит дезинфекция объектов окружающей среды с использованием различных дезинфицирующих средств (ДС), вызывающих гибель тех или иных видов болезнетворных микроорганизмов при регламентированных параметрах технологии их применения (режимах обработки).

ДС, обладающие туберкулоцидной активностью, необходимы для обеззараживания различных объектов, контаминированных возбудителем туберкулеза, отличающимся от всех других вегетативных форм болезнетворных бактерий более высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам, в т.ч. к дезинфицирующим средствам.

Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в мире в настоящее время остается напряженной, кроме того, она усугубляется появлением и распространением суперустойчивых к химическим противотуберкулезным веществам форм возбудителя. Такие микобактерии зачастую характеризуются более высокой сохраняемостью во внешней среде, что приводит к возникновению внутрибольничных вспышек нозокомиального туберкулеза. Кроме того, все чаще стали регистрироваться случаи заболеваний, вызванных нетуберкулезными видами микобактерий (НТМБ), которые обладают естественной резистентностью к воздействию негативных факторов окружающей среды. НТМБ являются возбудителями микобактериозов человека и наиболее опасны для больных с иммунодефицитными состояниями, т.к. существенно сокращают сроки их жизни.

В такой неблагоприятной эпидемической ситуации по туберкулезу и микобактериозам возрастает роль неспецифических противоэпидемических мероприятий, среди которых ведущую роль занимает химическая дезинфекция, направленная на уничтожение возбудителей на объектах внешней среды, имеющих значение в передаче инфекции.

Как известно, успех проведения химической дезинфекции напрямую зависит от соблюдения рекомендаций инструкций по применению дезинфицирующих средств, правильного выбора эффективного режима (концентрация, экспозиция, способ обработки). Помимо этого, дезинфекционные мероприятия будут эффективны лишь в том случае, когда режимы дезинфекции отработаны на адекватном по устойчивости к реальным возбудителям тест-микроорганизме.

В нашей стране для разработки туберкулоцидных режимов применения ДС используют сапрофитный штамм Mycobacterium , который изначально был предложен как тест-микроорганизм для оценки качества проведения камерной дезинфекции в очагах туберкулеза, поскольку обладал естественной резинстентностью к температурному фактору [2, 3]*. Более того, результаты исследований по сравнительной оценке устойчивости микобактерий к химическим веществам, проведенные в 50-60 гг. прошлого столетия, свидетельствуют о меньшей устойчивости Mycobacterium по сравнению с вирулентными штаммами микобактерий. Обоснованных экспериментальных данных по выбору Mycobacterium для оценки туберкулоцидной активности химических средств дезинфекции в открытой литературе не найдено.

________________

* См. раздел 8 Нормативные ссылки, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

За рубежом для разработки туберкулоцидных режимов применения ДС используют такие штаммы как М. Terrae и М. avium [4]. Насколько чувствительность к ДС всех перечисленных тест-микобактерий адекватна реальным возбудителям туберкулеза и микобактериозов сказать трудно, поскольку такие сведения в литературе отсутствуют.

В связи с вышесказанным представлялось актуальной задачей для дезинфектологии и фтизиатрической практики проведение экспериментов по сравнительной оценке чувствительности тест-микобактерий к воздействию ДС разных химических групп. Исследования, проведенные в НИИД и на базе лаборатории микробиологии и ПЦР диагностики Уральского НИИ фтизиопульмонологии (г.Екатеринбург), показали, что Mycobacterium является самым чувствительным к воздействию большинства ДС видом микобактерий. Наиболее устойчивыми оказались М. Terrae, M. Avium-intracellulara и М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Тест-микроорганизм М. Terrae является наиболее подходящей моделью для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС, поскольку в наибольшей степени соответствует устойчивости патогенных микобактерий.

На основании этих данных, а также учитывая, что сапрофитные микроорганизмы более удобны и безопасны в работе, чем патогенные виды микобактерий, наиболее адекватной моделью для тестирования химических ДС является М. Terrae. При оценке туберкулоцидной эффективности физических (температурных) методов дезинфекции в качестве тест-микроорганизмов рекомендуется использовать Mycobacterium .

Данные методические указания регламентируют методы и технологию изучения, а также оценки туберкулоцидной активности субстанций для производства ДС, туберкулоцидной активности и эффективности химических, физических и комбинированных ДС при обеззараживании различных объектов, контаминированных наиболее устойчивым видом микобактерий с учетом максимально возможного уровня контаминации объектов возбудителем туберкулеза в практических условиях.

Исследования туберкулоцидной активности субстанций, ДС и эффективности режимов применения ДС включают:

выбор и подготовку культур тест-микроорганизмов для изучения туберкулоцидной активности ДС и субстанций;

обеспечение стандартности условий проведения исследований туберкулоцидной активности ДС и субстанций;

методы исследований и оценки результатов туберкулоцидной активности ДС и субстанций in vitro (суспензионный метод, метод батистовых тест-объектов);

методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС с использованием искусственно контаминированных тест-микобактериями различных тест-объектов с целью разработки режимов обеззараживания тех или иных объектов в отношении возбудителя туберкулеза (поверхностей в помещениях, транспорта, санитарно-технического оборудования, мебели, посуды, белья, одежды, предметов ухода за больными, медицинских приборов, инструментов и других изделий медицинского назначения и т.д.);

методы исследований туберкулоцидной эффективности ДС в практических условиях.

3. Тест-микроорганизмы для изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций

К применению в отечественной медицинской практике для дезинфекции при туберкулезе предлагаются различные ДС как отечественного, так и зарубежного производства, имеющие туберкулоцидные режимы, разработанные с использованием наиболее устойчивых тест-микроорганизмов, что должно гарантировать их эффективность в отношении возбудителя.

Исследование и оценку туберкулоцидной и микобактерицидной (в отношении непатогенных микобактерий) активности ДС, предлагаемых для применения на территории России, проводят, используя в качестве тест-микроорганизмов:

агаровую культуру Mycobacterium для оценки эффективности и разработки туберкулоцидных режимов камерного обеззараживания различных объектов;

агаровую культуру Mycobacterium terrae (DSM 43227) для оценки активности ДС и разработки режимов их применения при обеззараживании в отношении возбудителя туберкулеза и микобактериозов;

агаровую культуру Mycobacterium tuberculosis для подтверждения эффективности разработанных режимов применения ДС в отношении возбудителей туберкулеза и микобактериозов в практических условиях.

3.1. Требования к тест-микроорганизмам

Тест-микобактерии должны иметь типичные морфологические, культуральные, биохимические, тинкториальные и ферментативные свойства, присущие данному штамму (прилож.1), и обладать стандартной устойчивостью к эталонным ДС и температуре. Культура Mycobacterium должна быть устойчива к температуре 60°С в течение 60 мин. Показатели устойчивости к химическим дезинфицирующим средствам, которым должна соответствовать культура Mycobacterium terrae приведены в табл.1.

Таблица 1

     
Устойчивость Mycobacterium terrae к эталонным дезинфицирующим агентам и средствам

Тест-микобактерии М. terrae могут быть приобретены в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) в Немецком музее микроорганизмов и клеточных культур (Deutcshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) под N DSM 43227. Тест-микобактерии штамма В могут быть приобретены в коллекции Музея микроорганизмов ФГУН Научно-исследовательского института дезинфектологии (ФГУН НИИД) Роспотребнадзора.

3.2. Получение и хранение исходной рабочей культуры тест-микобактерий

Для выращивания культур тест-микобактерий используют плотные питательные среды. Перечень и методика приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности ДС и их субстанций, приведены в прилож.2. В отличие от питательных сред, рекомендуемых в стандарте NEN-EN 14476*, использование приведенных в приложении питательных сред позволяет получать результат оценки туберкулоцидной активности ДС не на 21, а на 10-14 сутки.

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Для получения культуры штамма тест-микобактерий ампулу с лиофилизированной музейной культурой этого штамма вскрывают в асептических условиях следующим образом: ватным тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы, затем нагревают ее запаянный конец в пламени горелки до образования на ампуле трещины. К накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой. После этого ударом металлического инструмента (скальпель, пинцет) по трещине откалывают конец ампулы. Стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 1,0 мл стерильной дистиллированной воды и оставляют в течение 30 мин при комнатной температуре для растворения лиофилизата и получения суспензии. Суспензию, приготовленную из музейной тест-культуры, рассевают по 0,1 мл в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая" (всего 10 пробирок). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 5-7 суток.

С выросшими на питательных средах культурами М. terrae далее работают следующим образом:

полученную биомассу снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с поверхности питательной среды Левенштейна-Йенсена или "Новая" со всех пробирок;

помещают в пробирку с 10 мл бульона Миддлбрука 7Н9 с 10% ADC ростовой добавкой и гомогенизируют;

доводят объем полученной суспензии до 100 мл бульоном Миддлбрука 7Н9 и по 0,5 мл суспензии вносят в микропробирки;

подписывают на каждой пробирке наименование штамма и дату;

замораживают при -70°С и оставляют в таком состоянии для длительного хранения.

Это самый эффективный способ длительного (десятилетиями) хранения культур с обеспечением сохранения биологических свойств тест-микобактерий. При отсутствии такой возможности суспензию в микропробирках замораживают в бытовом холодильнике при -20°С. Срок хранения культуры в таких условиях - не более 5 лет.

Данная методика получения и хранения исходной рабочей культуры тест-микобактерий позволяет длительный период времени проводить испытания ДС с максимальным обеспечением стандартности свойств тест-микобактерий, в т.ч. по устойчивости к различным факторам, поскольку исключает необходимость многократного пересева, приводящего, как известно, к изменению биологических свойств микроорганизмов.

Полученная и хранящаяся таким образом культура тест-микобактерий используется для получения агаровой культуры тест-микобактерий (первый пассаж) и приготовления из нее рабочей суспензии тест-микобактерий, используемой для проведения испытаний ДС.

3.3. Приготовление рабочей суспензии тест-микобактерий, используемой в эксперименте при испытании дезинфицирующих средств, и контроль ее качества

Для получения первого пассажа культуры тест-штамма микобактерий, используемой при оценке ДС, необходимое для исследования количество хранящихся при температуре -70 или -20°С микропробирок (2 штуки на 1 исследование) с данным штаммом микобактерий размораживают при комнатной температуре, переносят по 0,1 мл содержимого в пробирки со скошенной питательной средой Левенштейна-Йенсена или "Новая" и инкубируют в термостате при 37°С в течение 14 суток. Выросшую на плотной питательной среде в пробирках культуру используют для приготовления рабочей суспензии тест-микобактерий данного штамма.

Одна или несколько пробирок может быть использована для получения второго пассажа культуры тест-микобактерий этого штамма. Для этого культуру первого пассажа в пробирке снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с плотной питательной среды, помещают в толстостенную стеклянную пробирку и тщательно растирают, постепенно добавляя по каплям стерильную дистиллированную воду. Полученную суспензию рассевают на плотную питательную среду тем же способом, который использовался для получения первого пассажа.

Культуры тест-микроорганизмов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур микобактерий тест-штаммов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды. Проводят микроскопию мазка выросших культур методом окраски по Циль-Нильсену (М. terrae представляют собой короткие прямые палочки малиново-красного цвета, располагающиеся в мазке параллельно друг другу, на подобие частокола. Размер клеток микобактерий 0,2-0,6х1-10 мкм).

Рабочую суспензию культуры тест-микобактерий готовят из тест-штамма первого и/или второго пассажей, выросших на плотной питательной среде. Дальнейшее субкультивирование недопустимо!

Для приготовления рабочей суспензии культуру микобактерий снимают платиновой лопаточкой или стеклянной палочкой с плотной питательной среды и помещают в толстостенную стеклянную пробирку. Микробную биомассу тщательно гомогенизируют, постепенно добавляя по каплям стерильную дистиллированную воду. Густую исходную бактериальную суспензию оставляют на 15 мин для осаждения негомогенизированных конгломератов и частиц. Полученную надосадочную жидкость отбирают пастеровской пипеткой, переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности (ФГУН "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича" Роспотребнадзора), и стандартизуют по оптическому стандарту мутности N 10 (он соответствует 1·10 микробных тел в 1 мл), добавляя стерильную дистиллированную воду.