ГОСТ Р 53360-2009

Группа С09

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения ферментативной активности фитазы

Enzyme preparation. Methods of detection of phytase activity

ОКС 07.100.30

        65.120

Дата введения 2010-01-01

     

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ "ВГНКИ") и Научно-техническим центром "Лекарства и биотехнология" (НТЦ "Лекбиотех")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 "Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2009 г. N 237-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методы определения ферментативной активности фитазы ферментных препаратов и ферментсодержащих смесей с использованием в качестве субстрата фитата натрия.

Примечание - Фермент фитаза - мио-инозит-гексафосфат 3-фосфогидролаза (3.1.3.8) [1], катализирует гидролитическое расщепление эфиров инозита и фосфорной кислоты (фитина), начиная с положения С, с высвобождением фосфатов.

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3765-78 Реактивы. Аммоний молибденовокислый. Технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9336-75 Реактивы. Аммоний ванадиевокислый мета. Технические условия

ГОСТ 10931-74 Реактивы. Натрий молибденовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты

ГОСТ 20264.0-74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24147-80 Аммиак водный особой чистоты. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

     3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на два более простых в присутствии молекул воды.

3.2 ферментативный гидролиз: Гидролиз высокомолекулярных соединений под воздействием катализаторов белковой природы - гидролитических ферментов (гидролаз, класс 3 [1]).

3.3 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

     4 Метод определения ферментативной активности фитазы с образованием молибденовой сини

4.1 Характеристика метода

4.1.1 Метод основан на количественном определении содержания неорганических фосфатов (РО), образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат - фитат натрия (натриевую соль фитиновой кислоты) при определенных стандартных условиях, путем их связывания молибдатом натрия и восстановлением двухлористым оловом с образованием окрашенного в синий цвет комплекса - молибденовой сини.

Метод используется при возникновении разногласий в качестве арбитражного.

4.1.2 За единицу фитазной активности (1 ед. ФА) принимают количество фермента, катализирующее гидролиз фитата натрия с образованием 1 мкмоля неорганического фосфата за одну минуту в стандартных условиях (температура 37 °С, значение рН 5,5, продолжительность гидролиза 15 мин).

4.1.3 Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрическим методом при длине волны от 650 до 700 нм.

4.1.4 Количество выделенных неорганических фосфатов определяют по градуировочному графику, построенному как функция оптической плотности от молярной концентрации фосфатов, мкмоль/см.

Метод позволяет определять от 0,05 до 0,40 мкмоль/см фосфатов. Диапазон измерений контролируемого показателя 500-8000 ед. ФА.

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

4.2.1 Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие средства измерений и оборудование:

- фотоэлектроколориметр (ФЭК) любого типа, который обеспечивает измерения при длине волны от 650 до 700 нм, с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1% (не более 0,01 единицы оптической плотности);

- рН-метр с набором электродов для измерения в диапазоне от 0 до 14 рН, с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,1 рН;

- магнитную мешалку любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин;

- ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры ±1 °С;

- лабораторную центрифугу любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 мин;

- весы лабораторные по ГОСТ 24104, высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, ценой поверочного деления 0,1 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,15 мг; с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, ценой поверочного деления 20 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±30 мг;

- водяную баню любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100±1) °С;

- таймер любого типа с погрешностью ±30 с;

- шкаф сушильный, обеспечивающий температуру нагрева (120±5) °С;

- вытяжной шкаф любого типа;

- механическую мельницу, обеспечивающую размалывание исследуемого образца ферментного препарата до полного прохода пробы через сито;

- сито с размером отверстий 1,0 мм, сделанное из металлического проволочного тканого материала.

4.2.2 Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие лабораторную посуду и материалы:

- колбы мерные 1(2)-50, 100, 200, 500, 1000-2 по ГОСТ 1770;

- воронки ВФ - 1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ 25336;

- пробирки П 1-14-120 ХС или П 1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;

- пипетки по ГОСТ 29227;

- пипетки автоматические с емкостью от 0,1 до 1,0 см с наконечниками;

- колбы и стаканы (бюксы) СВ 19/9 и 24/10 по ГОСТ 25336;

- стаканы В-1-25, 50, 100, 200, 600, 1000 ТС по ГОСТ 25336;

- цилиндры 1(2,3,4)-50, 100-1 по ГОСТ 1770;

- ступку и пестик фарфоровые по ГОСТ 9147;

- эксикатор любого исполнения по ГОСТ 25336.

4.2.3 Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие реактивы:

- воду бидистиллированную, дистиллированную дважды перегнанную или деионизированную, свободную от фосфатов по [2];

- калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;

- кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;

- натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199;

- натрия фитат с содержанием примеси кальция не более 2%;

- натрий молибденовокислый 2-водный (натрия молибдат) по ГОСТ 10931;