ГОСТ Р 53046-2008

Группа С09

     
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения ферментативной активности целлюлазы

Enzyme preparation. Methods of cellulasa enzyme activity determination

ОКС 07.100.30

        65.120

Дата введения 2010-01-01

     

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ "ВГНКИ") и Научно-техническим центром "Лекарства и биотехнология" (НТЦ "Лекбиотех")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 "Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 декабря 2008 г. N 415-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методы определения ферментативной активности целлюлазы ферментных препаратов с использованием двух субстратов: хроматографической бумаги и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Методы, установленные в настоящем стандарте, могут быть также использованы для определения ферментативной активности целлюлазы ферментсодержащих смесей, в т.ч. кормовых смесей и кормов.

Примечания

1 Активность целлюлазы (целлюлолитическую активность) природных объектов обеспечивает комплекс, содержащий, в основном, три типа ферментов: эндо-1,4--глюканазы, экзо-1,4--глюканазы и -глюкозидазы.

2 Системные названия ферментов:

- эндо-1,4--глюкан-4-глюканогидролазы (КФ 3.2.1.4) катализируют расщепление целлюлозы с образованием крупных фрагментов;

- экзо-1,4--глюканцеллобиогидролазы (КФ 3.2.1.91) отщепляют целлобиозу от нередуцирующего конца молекул целлюлозы и их фрагментов;

- экзо-1,4--глюкан-4-глюкогидролазы (КФ 3.2.1.74) отщепляют глюкозу от нередуцирующего конца цепей;

- -глюкозидглюкогидролазы (КФ 3.2.1.21), или -глюкозидазы (целлобиазы) катализируют гидролиз целлобиозы.

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4206-75 Реактивы. Калий железосинеродистый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5845-79 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-водный. Технические условия

ГОСТ 6038-79 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты

ГОСТ 20264.0-74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1:1981) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

     3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на два более простых в присутствии молекул воды.

3.2 ферментативный гидролиз: Гидролиз высокомолекулярных соединений под воздействием катализаторов белковой природы - гидролитических ферментов (гидролаз, класс 3).

3.3 системные названия ферментов: Названия, указывающие природу химической реакции, катализируемой данным ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ), принятой Международной комиссией по ферментам.

3.4 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

3.5 целлюлоза: Высокомолекулярное соединение, полимер глюкозы.

3.6 целлюлолитический комплекс ферментов: Комплекс гидролитических ферментов, расщепляющий целлюлозу до конечного продукта - глюкозы.

     4 Метод определения ферментативной активности целлюлазы с использованием субстрата хроматографической бумаги

4.1 Характеристика метода

4.1.1 Метод основан на количественном определении восстанавливающих сахаров, образующихся в результате гидролиза целлюлозы хроматографической бумаги под действием ферментов целлюлолитического комплекса.

Метод используется при возникновении разногласий в качестве арбитражного.

4.1.2 За единицу целлюлолитической активности (1 ед. ЦлА) принято количество ферментов, которое катализирует гидролиз целлюлозы хроматографической бумаги с образованием 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу) за 1 ч при температуре 50 °С и рН 4,7.

4.1.3 Содержание восстанавливающих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом с использованием реактива динитросалициловой кислоты или калия железосинеродистого (красной кровяной соли, калия феррицианида, калия гексационоферрата) и рассчитывают по градуировочному графику, построенному для глюкозы. Диапазон измерений контролируемого показателя 0,5-25,0 ед. ЦлА.

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

4.2.1 Для определения ферментативной активности целлюлазы используют следующие средства измерений и оборудование:

- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр (СФ) любого типа, которые обеспечивают измерения при длине волны 540 нм и погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1% (не более 0,01 D (ед. ОП));

- рН-метр любого типа для измерения в диапазоне от 0 до 14 рН, пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,1 ед. рН;

- магнитную мешалку любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин;

- ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры ±1 °С;

- лабораторную центрифугу любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 мин;

- весы лабораторные высокого или специального класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г и ценой поверочного деления 0,1 мг по ГОСТ 24104;

- секундомер механический с пределом измерений 60 мин с ценой деления 0,2 с;

- водяную баню любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100±1) °С;

- таймер любого типа с погрешностью ±30 с;

- механическую мельницу, обеспечивающую размалывание исследуемого образца ферментного препарата до полного прохода пробы через сито;

- сито с размером отверстий 1,0 мм, сделанное из металлического проволочного тканого материала.

4.2.2 Для определения ферментативной активности целлюлазы используют следующие лабораторную посуду и материалы:

- колбы мерные 1(2)-50, 100, 200, 500,1000-2 по ГОСТ 1770;

- воронки ВФ-1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ 25336;

- пробирки П 1-14-120 ХС или П 1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;

- пипетки по ГОСТ 29227;

- автоматические пипетки номинальной вместимостью от 0,1 до 1,0 см с наконечниками;

- колбы и стаканы (бюксы) СВ 19/9 и 24/10 по ГОСТ 25336;

- стаканы В-1-25, 50, 100, 150, 250, 600, 800, 1000 ТС по ГОСТ 25336;

- цилиндры 1 (2, 3, 4)-50 (100) по ГОСТ 1770;

- ступку и пестик фарфоровые по ГОСТ 9147.

4.2.3 Для определения ферментативной активности целлюлазы используют следующие реактивы:

- кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;

- натрий уксуснокислый трехводный по ГОСТ 199;

- калий-натрий виннокислый четырехводный по ГОСТ 5845;

- калий железосинеродистый по ГОСТ 4206;

- натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

- кислоту 3,5-динитросалициловую по действующим документам (ДНС);