ГОСТ 20264.3-81

Группа С09

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения активности пектолитического комплекса

Enzyme preparations.
Methods for determination of pectolytic complex activity

     

МКС 07.100.30
         65.120
ОКСТУ 9291

Дата введения 1982-07-01

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 15 апреля 1981 г. N 1973 дата введения установлена 01.07.82

Ограничение срока действия снято по протоколу N 2-92 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93)

ВЗАМЕН ГОСТ 20264.3-74

ИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в январе 1987 г. (ИУС 4-87).

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты микробного происхождения и устанавливает методы определения активности пектолитического комплекса.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб - по ГОСТ 20264.0-74.

1.2. Все весовые определения проводятся на лабораторных весах общего назначения по ГОСТ 24104-88* 1 и 2-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г. Допускается применение других весов с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками.

________________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.

(Введен дополнительно, Изм. N 1).

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПкС)
(интерферометрический метод)

2.1. Сущность метода

Метод основан на определении пектолитических ферментов при каталитическом расщеплении пектина.

За единицу пектолитической активности должно быть принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых сернокислым цинком при проведении гидролиза в строго определенных условиях: температура 30 °С, время гидролиза 1 ч, величина рН реакционной среды 4,0; соотношение фермент-субстрат в реакционной среде, обеспечивающее гидролиз 30%-ного пектина, взятого на реакцию.

Пектолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Количество продуктов гидролиза пектина, не осаждаемых сернокислым цинком, определяют на интерферометре.

2.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Интерферометр типа ИТР-2 или ЛИР-2.

Мешалка любой марки.

Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.

Термометры 0-150 °С по ГОСТ 28498-90 с ценой деления 1 °С.

Пробирки стеклянные диаметром 15-18 мм по ГОСТ 25336-82.

Стаканчики для взвешивания вместимостью 25-30 см по ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные 2-50, 500-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 250, 300, 500 см.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.

Фильтры обеззоленные. Синяя лента.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35% и содержанием основного вещества не менее 70%.

Сахароза по ГОСТ 5833-75, раствор с массовой долей сахарозы 0,25%.

Цинк сернокислый по ГОСТ 4174-77, раствор с массовой долей сернокислого цинка 15%.

Аммиак водный по ГОСТ 3760-79.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

2.3. Подготовка к анализу

2.3.1. Приготовление основного ферментного раствора из очищенных порошкообразных препаратов

0,1000 г (или 1,0000 г) исследуемого препарата взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г в стаканчике вместимостью 25-30 см. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см (500 см), доводят водой до метки и перемешивают. С целью избежания адсорбции фермента на наполнителе необходимо процессы растворения и фильтрации проводить неразрывно: после растворения стандартизованных препаратов раствор сразу же фильтруют через беззольный фильтр. Из фильтрата отбирают определенное количество раствора в зависимости от активности препарата для проведения анализа в соответствии с табл.1.

Таблица 1

2.3.2. Приготовление основного ферментного раствора из поверхностной культуры гриба

1,00 г измельченной воздушно-сухой культуры гриба взвешивают с погрешностью не более 0,01 г, переносят в стакан вместимостью 250 см, заливают 100 см дистиллированной воды и выдерживают в течение 1 ч при 30 °С при периодическом перемешивании. Полученный ферментный экстракт фильтруют через бумажный фильтр и из фильтрата, в зависимости от активности культуры, в соответствии с табл.2 отбирают определенное количество в колбу вместимостью 50 см и доводят водой до метки. Содержимое перемешивают и используют для определения пектолитической активности.

Таблица 2

2.3.3. Приготовление раствора с массовой долей пектина 1% (субстрат)

Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 250 см раствора было 2,5 г чистого пектина (см. обязательное приложение), тонкой струей всыпают при непрерывном перемешивании на мешалке в коническую колбу вместимостью 300 см, куда предварительно наливают около 130 см дистиллированной воды. Раствор перемешивают в течение 3 ч на мешалке при комнатной температуре. По истечении этого времени в раствор добавляют при перемешивании определенное количество концентрированного раствора аммиака для установления рН 4,0. Затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 250 см, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли.

Раствор пектина готовят не менее чем за 4 ч до проведения анализа.

Раствор пектина можно использовать в течение 2-3 сут при условии хранения в холодильнике.

2.3.4. Проверка интерферометра

Интерферометр проверяют раствором сахарозы. В правую секцию кюветы интерферометра с длиной грани 4 см наливают дистиллированную воду, в левую - приготовленный раствор сахарозы.

Поправочный коэффициент () вычисляют по формуле

,

     
где 780 - показание прибора;

- показание прибора при проверке раствором сахарозы.

2.4. Проведение анализа

Для анализа берут несколько пробирок диаметром 2 см и высотой 18 см по количеству исследуемых проб. В каждую пробирку наливают по 20 см субстрата и ставят их в термостат с температурой (30±0,2) °С. В термостате пробирки выдерживают в течение 10 мин для того, чтобы растворы приняли постоянную температуру. Затем наливают в каждую по 10 см испытуемого ферментного раствора, предварительно подогретого до 30 °С, содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают и оставляют в термостате при 30 °С на 1 ч для проведения гидролиза.

По истечении этого времени в пробирки с реакционной смесью добавляют по 2 см раствора сернокислого цинка для инактивации фермента и осаждения продуктов гидролиза и вынимают из термостата.

Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают путем встряхивания не менее 10 раз и фильтруют через фильтр.

Если фильтрат будет мутным, то его необходимо заново профильтровать через тот же фильтр до получения прозрачного раствора. Полученный раствор является исследуемым.

Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 см раствора сернокислого цинка, 10 см исследуемого ферментного раствора и 20 см субстрата.

Измерение проводят на интерферометре. Для этого исследуемый раствор наливают в левое отделение кюветы интерферометра с длиной грани 4 см, а контрольный раствор в правое отделение и измеряют величину смещения интерференционных полос, возникающую вследствие различия показателей преломления контрольного и исследуемого растворов. Отсчет ведут по шкале барабана прибора.

Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбирать таким образом, чтобы получать показания прибора от 400 до 1250