ГОСТ 20909.2-75*

Группа Р39

     

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ

Методы микробиологических исследований

Non-diluted sperm of bulls. Methods of microbiological tests

  Дата введения 1976-07-01

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 13 июня 1975 г. N 1557 срок введения установлен с 01.07.76

Проверен в 1985 г. Постановлением Госстандарта от 10.10.85 N 3300 срок действия продлен до 01.07.91**

________________     

** Ограничение срока действия снято постановлением Госстандарта СССР от 27.06.91 N 1129 (ИУС N 10, 1991 год). - Примечание изготовителя базы данных.

* ПЕРЕИЗДАНИЕ (август 1988 г.) с Изменением N 1, утвержденным в июне 1988 г. (ИУС 8-81).

Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную свежеполученную сперму быков и устанавливает методы микробиологических исследований с целью определения общего количества бактерий в сперме и ее коли-титра (коли-индекса).

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб - по ГОСТ 20909.1-75.

2. ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

2.1. Для проведения испытаний применяют:

потенциометр рН-340 или другой марки того же класса точности;

автоклав вертикальный;

шкаф сушильный;

термостаты;

микроскопы биологические марки МБИ или МРБ по ГОСТ 8284-78;

часы песочные;

лупу с увеличением 8-10 или камеру Вольфгюгеля для подсчета колоний;

прибор для подсчета колоний;

груши резиновые;

чашки биологические (Петри);

стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284-75;

стаканчики (бюксы) по ГОСТ 25336-82;

пипетки по ГОСТ 20292-74*, колбы по ГОСТ 1770-74;

________________

* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91. - Примечание изготовителя базы данных.

пробирки стеклянные по ГОСТ 25336-82;

поплавки стеклянные;

агар по ГОСТ 17206-84*;

______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 17206-96. - Примечание изготовителя базы данных.

пептон по ГОСТ 13805-76;

лактозу;

глюкозу медицинскую по ГОСТ 6038-79;

бульон мясопептонный (МПБ);

маннит;

насыщенный водный раствор нейтральрота;

фуксин основной, 5 и 10%-ный спиртовые растворы;

нейтральный красный (нейтральрот), насыщенный водный раствор;

аммиак водный по ГОСТ 3760-79;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

натрий сернистокислый (сульфит натрия) кристаллический, 10%-ный водный раствор;

метиленовый голубой;

натрий углекислый безводный (кальцинированная сода) по ГОСТ 83-79;

двухромовокислый калий по ГОСТ 4220-75;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67*, 96%-ный или спирт этиловый гидролизный высшей очистки, 96%-ный;

_______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000. - Примечание изготовителя базы данных.

кислоту серную по ГОСТ 4204-77;

калия гидроокись по ГОСТ 24363-80;

калий йодистый по ГОСТ 4232-74, 0,5%-ный спиртовый раствор;

йод по ГОСТ 4159-79;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77;

генцианвиолет, 1%-ный водный раствор;

кристаллический фиолетовый;

масло иммерсионное по ГОСТ 13739-78;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

порошок стиральный для хлопчатобумажной и льняной ткани;

мыло хозяйственное 72%-ное;

эфир петролейный.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЯМ

3.1. Подготовка лабораторной посуды и материалов

3.1.1. Новую лабораторную посуду кипятят в течение 15 мин в дистиллированной воде, подкисленной соляной кислотой до 1-2%, или выдерживают 3-4 ч в 10%-ном растворе соляной кислоты, а затем промывают водопроводной водой и моют с помощью ерша в растворе, содержащем на 1000 мл дистиллированной воды: стирального порошка - 30 г и нашатырного спирта 50 мл, или в растворе, содержащем на 1000 мл дистиллированной воды: хозяйственного мыла - 80 г (нарезанного на мелкие кусочки), кальцинированной соды - 40 г.

Раствор с хозяйственным мылом кипятят до полного растворения мыла. Затем лабораторную посуду тщательно промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой, высушивают на доске с колышками и стерилизуют.

3.1.2. Лабораторную посуду, бывшую в употреблении и сильно загрязненную, моют 2-3%-ным раствором двууглекислой или 1-1,5%-ным раствором кальцинированной соды, оставляют на 24 ч в хромовой смеси (смесь двухромовокислого калия и серной кислоты), тщательно промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой и подвергают стерилизации.

Предметные и покровные стекла обезжиривают погружением их не менее чем на 24 ч в смесь, состоящую из равных частей спирта и эфира.

Чистоту стекла вымытой и высушенной посуды контролируют нанесением на его поверхность капли воды. При достаточном обезжиривании капля расплывается равномерно.

Перед стерилизацией лабораторную посуду (чашки, пипетки, пробирки и т.п.) завертывают в пергаментную бумагу или укладывают в металлические пеналы. В верхний конец пипетки вкладывают кусочек ваты.

Вымытую лабораторную посуду после высушивания стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа (1 кгс/см) в течение 20 мин или в сушильном шкафу при 160-180 °С в течение 2 ч.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.2. Приготовление сред и реактивов

3.2.1. Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ)

Парное говяжье (или конское) мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают и заливают двойным количеством водопроводной воды, отмечают первоначальный объем смеси и ставят при температуре 4-6 °С на 12-24 ч или выдерживают в термостате при температуре 50 °С в течение 1 ч. Затем кипятят 30-60 мин. Мясную воду охлаждают (жир застывает и легко удаляется), фильтруют через ватно-марлевый или двойной бумажный фильтр до полной прозрачности и доводят до первоначального объема, доливая водопроводную воду.

К мясной воде добавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлористого натрия. Устанавливают рН 7,2-7,4, добавляя насыщенный раствор двууглекислой соды или 10%-ный раствор едкого натра. Раствор кипятят в течение 30 мин, доливают водой до первоначального объема, фильтруют через двойной бумажный фильтр и окончательно устанавливают рН 7,2-7,4. Затем разливают в пробирки или бутылки и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С. Если после стерилизации в МПБ выпадает осадок, то его фильтруют вторично и снова стерилизуют.

3.2.2. Приготовление мясо-пептонного агара (МПА)

К мясо-пептонному бульону добавляют 2% агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой, и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Агар в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 10-20 мин. К расплавленному МПА добавляют стерильный концентрированный (40%-ный и более) раствор глюкозы из расчета ее содержания в МПА в количестве 1% и дробно стерилизуют текучим паром по 30 мин каждый раз три дня подряд или однократно в автоклаве в течение 30 мин при температуре 105-110 °С.

Вместо указанного МПА применяют также готовый сухой питательный агар, из которого готовят питательную среду в соответствии с указаниями, прилагаемыми к препарату, и добавляют 1% глюкозы. Каждую новую серию сухого питательного агара обязательно проверяют на качество (ростовые свойства) путем посева разных бактериальных культур. Рост культур контролируют, высевая те же культуры на МПА, который приготавливают в лабораторных условиях. Если рост на среде из сухого питательного агара неудовлетворительный (колоний в посеве вырастает меньше на 15% и более по сравнению с контролем), то к такой среде добавляют в количестве 1/4-1/3 части от первоначально взятого объема МПБ и снова контролируют качество среды.

3.2.3. Приготовление изотонического раствора хлористого натрия

В 1 л водопроводной воды растворяют 9,0 г хлористого натрия. Раствор разливают в пробирки по 5 или 10 мл, учитывая, что после стерилизации объем в пробирках должен составлять соответственно 4,5 или 9 мл. Стерилизуют раствор при температуре 120 °С в течение 20 мин.

3.2.4. Приготовление среды Эндо

К 100 мл 2%-ного МПА (рН 7,4-7,6), расплавленного и охлажденного до 70 °С, добавляют 1 г лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, прогретой в водяной бане при температуре 100 °С в течение 5 мин.

В отдельных пробирках готовят 10%-ный спиртовой раствор основного фуксина и 10%-ный водный раствор сернистокислого натрия.

К 0,5 мл отфильтрованного спиртового раствора основного фуксина добавляют водный раствор сернистокислого натрия до получения бледно-розового окрашивания. Приготовленную смесь приливают к 100 мл расплавленного МПа с лактозой, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Среду готовят в день применения. Применяют также и сухую готовую среду Эндо.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.2.5. Приготовление среды Булира

К МПБ добавляют 0,25% маннита и рН среды доводят до 7,0-7,4. Затем питательную среду помещают в автоклав, где выдерживают при температуре 115-120 °С и кипятят в течение 15 мин. Добавляют насыщенный водный раствор нейтральрота (порошок растворяют в воде, нагретой до кипения) до окрашивания смеси в вишнево-красный цвет. Смесь фильтруют, разливают по 7 мл в пробирки с поплавками и выдерживают в автоклаве при температуре 120 °С в течение 15 мин.