• Текст документа
  • Статус
Оглавление
Поиск в тексте
Действующий


МУК 4.2.2959-11

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     
     
4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения



Дата введения: с момента утверждения


1. РАЗРАБОТАНЫ Управлением Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Краснодарскому краю (В.П.Клиндухов, П.Н.Николаевич); Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии в Краснодарском крае" (В.В.Пархоменко, Е.П.Лаврик, Л.И.Щербина) под редакцией ГОУ ВПО "Кубанский государственный университет" (Г.А.Лещева); Федеральным государственным бюджетным учреждением "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды" им. А.Н.Сысина Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (А.Е.Недачин, Т.З.Артемова, Е.К.Гипп, Р.А.Дмитриева, Т.В.Доскина, А.В.Загайнова, Н.Н.Буторина, В.А.Долгин, Т.Н.Максимкина); Федеральным государственным учреждением науки Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.М.Трухина, Н.Н.Мойсеенко); Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (В.П.Сергиев, А.И.Чернышенко, Г.И.Новосильцев, Е.А.Черникова, Н.А.Турбабина).

2. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 июля 2011 г.

3. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ 29 июля 2011 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее МУК) устанавливают методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа качества прибрежных вод морей в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими требованиями к охране прибрежных вод морей от загрязнения в местах водопользования населения (СанПиН 2.1.5.2582-10).

1.2. Методические указания предназначены для индивидуальных предпринимателей, юридических лиц, деятельность которых может привести к загрязнению воды морей и оказать неблагоприятное влияние на здоровье населения, а также для органов, уполномоченных осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством прибрежных вод морей.

1.3. Производственный контроль состава и свойств сточных вод и морской воды в контрольных пунктах охраняемых районов обеспечивается водопользователями самостоятельно, либо с привлечением аккредитованной на данный вид деятельности лаборатории.

1.4. Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ проб прибрежных вод морей осуществляется в соответствии с СанПиН 2.1.5.2582-10 по основным показателям: общие колиформные бактерии, Е. coli, энтерококки, стафилококки и колифаги; дополнительным показателям: возбудители кишечных инфекционных заболеваний (сальмонеллы и шигеллы), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, вирусы (энтеровирусы, ротавирусы, вирусы гепатита А); показателям, определяемым в период начала купального сезона, максимальной антропогенной нагрузки и по эпидемическим показаниям: жизнеспособные яйца гельминтов (аскарид, власоглавов, токсокар, фасциол), цисты патогенных кишечных простейших, ооцисты криптоспоридий.

2. Нормативно-методические документы


В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические документы:

1. СанПиН 2.1.5.2582-10 "Гигиенические требования к охране прибрежных вод морей от загрязнения в местах водопользования населения".

2. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

3. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

4. МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

5. МУК 4.2.2314-08 "Методы санитарно-паразитологического анализа воды".

6. МУК 4.2.2321-08 "Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах".

7. МУК 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический контроль водных объектов".

8. МУК 4.2.1884-04 "Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов".

9. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации НК при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

10. МУ 2.1.4.1057-01 Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".

11. ГОСТ Р 53415-2009 "Вода. Отбор проб для микробиологического анализа воды".

12. ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб".

13. ГОСТ 6709-72 "Вода дистиллированная. Технические условия".

14. ГОСТ 26670-91 "Методы культивирования микроорганизмов".

15. ГОСТ Р 52426-2005 "Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации".

16. МР 24 ФЦ/513. Определение колиформных бактерий и Е. coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства компании "Merck" (Германия)".

17. МР "Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)".

18. МР 96/225 "Контроль качества и безопасности минеральных вод по химическим и микробиологическим показателям".

19. МР 01/15702-8-34 "Микробиологическая диагностика кампилобактериоза. Методические рекомендации".

20. ПНД Ф 12.15.1-08 "Методические указания по отбору проб для анализа сточных вод".

3. Оборудование, расходные материалы для работ по микробиологии и паразитологии

1. Приборы для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройства для создания разрежения (0,5-1,0) атм. типа ПВФ-142, ОФФ-25, "ПробоКонг-СЭС-М3", ПВФ-142ВБ, ПМФ-70, АФ 142 "К", "Н".

2. Водяная баня или термостат для температурного режима 45-49 °С (для питательных сред).

3. Термостаты, поддерживающие рабочую температуру (37±1) °С, (44±0,5) °С, (50±1) °С.

4. Стерилизатор суховоздушный

5. Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 200 °С с ценой деления шкалы 1 °С.

6. Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 50 °С с ценой деления шкалы 0,5 °С

7. Логгеры (мониторинг температуры в термостате).

8. Термометр спиртовой с диапазоном измерения от -50 до 50 °С с ценой деления шкалы 1 °С для измерения температуры в холодильниках.

9. Стерилизатор паровой, режим работы от 0 до 2,5 кгс/смМУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения.

10. Ламинарный бокс для культуры клеток (класс не ниже 2).

11. Центрифуга лабораторная рефрижераторная WKH-1VH.

12. Микроцентрифуга для пробирок со скоростью вращения 10000-16000 об./мин.

13. Нагревательный прибор для варки питательных сред, либо магнитные мешалки с подогревом до 300 °С.

14. Микроскоп стереоскопический, обеспечивающий увеличение от 305 до 119х, с полем зрения 39-1,9 мм.

15. Инвертированный микроскоп для просмотра флаконов с культурами клеток при анализе на энтеровирусы.

16. Микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение от 84х до 1350х.

17. Весы лабораторные общего назначения 4 класса точности, с пределом взвешивания до 1000 г, допустимая погрешность не более 0,1 г по ГОСТ 24104-80.

18. Микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение от 84х до 1350.

19. Весы лабораторные общего назначения 4 класса точности, с пределом взвешивания до 200 г, допустимая погрешность не более 0,02 г.

20. РН-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01.

21. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды, отвечающий ГОСТ 6709-72.

22. СОМУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения инкубатор, обеспечивающий температуру до 50 °С.

23. Холодильники бытовые электрические с температурой в камере 4-6 °С.

24. Низкотемпературный морозильник с температурой в камере (-70 °С).

25. Иммуноферментный анализатор (ИФА).

26. Стерильный фильтрующий материал для микробиологических целей (мембранные фильтры, аналитические трековые мембраны и другие фильтрующие материалы с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм) проверенной ранее партии или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, разрешенные к применению в установленном порядке.

27. Мембрана микропористая капроновая (ММК диаметр пор 0,2 мкм).

28. Мембрана для концентрирования вирусов из воды типа ФМНЦ-0,2 мкм.

29. Мембранные фильтры для паразитологических исследований с размерами пор 1,5-3,0 мкм, размерами пор 2,4-4,5 мкм, трековые микрофильтрационные мембраны с диаметром пор 1,0-3,05 мкм.

30. Трековые микрофильтрационные мембраны (ATM) с диаметром пор 5,0 и 2,5 мкм и префильтр (капроновая сетка) с диаметром пор 25,0 и 67-70 мкм для паразитологических исследований.

31. Облучатель бактерицидный.

32. Оптический стандарт мутности на 10 ед.

33. Часы сигнальные или песочные на 2, 3, 5 мин.

34. Макропористое стекло марки МПС 1000 ВГХ.

35. Набор для концентрирования с помощью пакетов с адсорбентом.

36. Ионообменная смола (Анионит АВ 17-8).

37. Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованного хозяйственно-бытового водоснабжения, поверхностных и сточных вод.

38. Дозаторы пипеточные полуавтоматические переменного объема 0,5-10 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл с наконечниками.

39. Горелки газовые или спиртовки.

40. Петли бактериологические.

41. Пинцеты для работы с мембранными фильтрами.

42. Штативы для пробирок.

43. Емкости эмалированные.

44. Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром и автоклавированием.

45. Вата хлопковая медицинская гигроскопическая.

46. Марля медицинская.

47. Маркеры водостойкие.

48. Резиновые перчатки.

49. Шпагат.

50. Бумага плотная для упаковки посуды.

51. Штативы для пробирок 0,6 и 1,5 мл.

52. Планшеты пластиковые для культивирования культур тканей.

53. Батометр с устройством для закрепления стерильных емкостей.

54. Батометр специальный для отбора проб с разных глубин.

Примечание.

1. Для экспресс анализа индикаторных и патогенных микроорганизмов в воде может использоваться микробиологический анализатор "БакТрак-4300" в соответствии с МУК 4.2.1111-02 "Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-микробиологического исследования питьевой воды".

2. Для идентификации выделенных культур допускается применение автоматических микробиологических анализаторов (например, VITEK 2 Compact - Методические рекомендации N 02.032-08).

4. Реагенты и реактивы для микробиологии и паразитологии

Калий хлористый

ГОСТ 3118-77

Калий фосфорно-кислый однозамещенный

ГОСТ 4198-75

Калий фосфорно-кислый двузамещенный 3-водный

ГОСТ 2483-75*

_______________
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 2493-75. - Примечание изготовителя базы данных.

Калия гидроокись

ГОСТ 24363-80

Калия сульфат

ГОСТ 4145-74

Калий йодистый

ГОСТ 4232-74

Калий азотно-кислый (нитрат калия)

ГОСТ 19790-74*

_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 53949-2010. - Примечание изготовителя базы данных.

Кислота соляная

ГОСТ 3118-77


ГОСТ 14261-77

Кислота ортофосфорная

ТУ 6-09-4229-76*

________________
* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

Кислота борная

ТУ 6-09-17-263-89

ГОСТ 9656-75

Натрий хлористый

ГОСТ 4233-77

Натрий гидрат окиси

ГОСТ 4328-77

или

ГОСТ 9285-78*

_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Натрий фосфорно-кислый трехзамещенный

ГОСТ 201-76

Натрий серноватисто-кислый (тиосульфат натрия) 5-водный

ГОСТ 27068-86

Натрий двууглекислый

ГОСТ 2156-76

Фосфат натрий-аммония двузамещенный, 4-водный

ГОСТ 4170-78

Натрий сернисто-кислый пиро (метабисульфит)

ГОСТ 10575-76*

_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 6-09-4327-78. ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

Натрий пировинограднокислый (пируват)

ТУ 6-09-08-990-75

Спирт этиловый ректификованный медицинский

ГОСТ 51652-2000

Активированный уголь

Р.72.270.3*

_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-84*

_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 17206-96. - Примечание изготовителя базы данных.

D-глюкоза

ГОСТ 6038-79

L-лактоза

ГОСТ 6038-74*

_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Мальтоза

Sigma (Германия)

D-маннит

ГОСТ 8321-74*

_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 6-09-5484-90, являющиеся авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

L-аргинин гидрохлорид (Германия)

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей

ГОСТ 13805-76

Дрожжевой экстракт

ГОСТ 171-81

Трифенилтетразолий хлорид

ТУ 6-09-3838-78

Тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид

(TEMED)

Диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид

ТУ 6-09-1903-77

МУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения-нафтол

ГОСТ 5838-79*

_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 6-09-5417-88, являющиеся авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

Пара-диметиламинобензальдегид

ТУ 6-09-3272-77

Амиловый спирт

ГОСТ 5830-79

Триптофан

(США)

Азид-натрия

(Германия)

Глицерин

ГОСТ 6824-96

Кальций углекислый

ГОСТ 4530-76

Бриллиантовый зеленый

ТУ 6-09-4278-76

Бромтимоловый синий спирторастворимый

ТУ 6-09-5423-90

Кристаллический фиолетовый

ТУ 6-09-4119-82

Раствор Люголя

сертификат 78-1683233;

Йод кристаллический

ТУ 211.003.033.88;

Барий хлористый

ГОСТ 4108-72

Магний хлористый кристаллический 6-водный

ГОСТ 4209-77

Сульфат магния

ГОСТ 21458-75*

_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Тетратианат калия

ТУ 6-09-3838-78

Калийная соль б-кетоглютаровой кислоты

(Россия)

МУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения-кетоглютаровая кислота

(Россия)

Глицин, Biotechnology Grade >99%

(Amresco, США)

Пирофосфат железа растворимый

ГОСТ 4147-74

или

ГОСТ 342-77

Буферный угольно-дрожжевой агар

Глицин, Biotechnology Grade> 99%

(Amresco, США)

L-цистеин

(Япония)

Пирофосфат железа растворимый

(Sigma, США)

Полимиксин В сульфат 500000 ед.

(Германия)

Циклогексимид

(Германия)

ACES-буфер (N-2-ацетамидо-2-аминоэтан-сульфанильная кислота)

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

Приборы мембранного фильтрования для санитарно-гельминтологического исследования морской воды:

1) вакуумные фильтровальные установки типа ПВФ-142, ПВФ-35, ПВФ-47;

2) напорного фильтрования типа ПНФ, УППВ.

Приборы порошкового фильтрования:

1) напорного фильтрования типа ПробоКонг и его модификации;

2) отборник флотанта фильтрующий типа "ОФФ-25":

Лабораторная центрифуга типа ОПН-3, ОПН-8, ЦЛС-31М, ОС-6М со сменным ротором или другие марки с аналогичными параметрами, обеспечивающие 1500-3000 об./мин, позволяющие центрифугировать пробы воды в центрифужных пробирках объемом от 10 мл

Ареометры с пределами измерения от 1,000 до 1,400 кг/мМУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения;

Световые микроскопы отечественные типа МИКМЕД-2 (вариант 2) и других фирм, оснащенные окулярами с увеличением 10х (дополнительно могут быть 7х и 5х), объективами 10х, 40х, 100х. Окуляр-микрометр и объект-микрометр;

Мембранные фильтры для фильтрования воды на основе ацетатов целлюлозы типа МФАС-СПА с размерами пор от 1,5 до 3,0 мкм, МФАС-СПА-4 с размерами пор от 2,5 до 4,5 мкм или прозрачные аналитические трековые мембраны ATM на основе полиэтилентерефталата с размерами пор от 1,0 до 5,0 и более мкм. Диаметр фильтровальных дисков 25, 35, 47, 70 и до 142 мкм, в зависимости от диаметра фритты фильтродержателя используемого фильтровального оборудования

Предфильтры - капроновая сетка с ячейками 60-70 мкм

Ёмкости для отбора проб воды из нейтрального материала, пригодные для обеззараживания (широкогорлые стеклянные или пластиковые флаконы емкостью 100*
_________________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

500 мл с притертым или завинчивающимися крышками, металлические или пластиковые канистры емкостью 10-25 л, стеклянные бутыли, фляги молочные металлические, эмалированные бидоны и др.;

Лабораторный вортекс, лабораторный ротатор;

Лотки эмалированные, металлические, эмалированные кастрюли, ведра;

Предметные стекла;

Часы песочные на 3-5 мин, часы сигнальные или электронный таймер;

Кисти акварельные широкие (мягкие или полужесткие).


5. Оборудование и расходные материалы для ПЦР


ЗОНА 1. Выделение ДНК/РНК из образцов

1. Ламинарный бокс (например, "БАВп-01-"Ламинар-С"-1,2", "Ламинарные системы", Россия, класс биологической безопасности II тип А).

2. Вортекс (например, "ТЭТА-2", "Биоком", Россия).

3. Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, "Ленпипет", Россия).

4. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки объемом 1,5 мл (например, "Axygen", США).

5. Одноразовые наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, "Axygen", США).

6. Штативы для наконечников (например, "Axygen", США) и микропробирок объемом 1,5 мл (например, "ИнтерЛабСервис", Россия).

7. Холодильник от 2 до 8 °С.

8. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

9. Ёмкость с дезинфицирующим раствором.

При использовании комплекта реагентов "РИБО-преп"

1. Термостат для пробирок типа "Эппендорф" от 25 до 100 °С (например, "ТЕРМО 24-15", "Биоком", Россия).

2. Микроцентрифуга для пробирок типа "Эппендорф" до 16 тыс. об./мин (например, "MiniSpin", "Eppendorf", Германия).

3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, "ОМ-1", г. Ульяновск, Россия).

4. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, "Axygen", США).

При использовании комплекта реагентов "МАГНО-сорб"

1. Термостат для пробирок объемом 5 мл, диаметром 12 мм от 25 до 100 °С (например, "BioerTechnology", Китай )

2. Термостат для пробирок типа "Эппендорф" от 25 до 100 °С (например, "ТЕРМО 24-15", "Биоком", Россия).

3. Магнитный штатив для пробирок типа "Эппендорф" на 1,5 мл (например, "Promega", США).

4. Магнитный штатив для пробирок на 5 мл, диаметр 12 мм (например, "Promega", США).

5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, "ОМ-1", г. Ульяновск, Россия).

6. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки объемом 1,5 мл (например, "Axygen", США).

7. Одноразовые полипропиленовые или полистирольные пробирки объемом до 5 мл диаметром 12 мм, круглодонные (например, "Axygen", США).

8. Одноразовые полипропиленовые крышки для пробирок объемом до 5 мл диаметром 12 мм (например, "Axygen", США)

9. Электронный или механический дозатор переменного объема с возможностью дозирования от 1000 до 5000 мкл (например, "Ленпипет", Россия)

10. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл, до 1000 мкл и до 5000 мкл (например, "Axygen", США).

ЗОНА 2. Проведение реакции обратной транскрипции, ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР-амплификации

1. ПЦР-бокс (например, "БАВ-ПЦР-"Ламинар-С", "Ламинарные системы", Россия).

2. Вортекс (например, "ТЭТА-2", "Биоком", Россия).

3. Набор электронных или автоматических дозаторов переменного объема (например, "Ленпипет", Россия).

4. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл (например, "Axygen", США).

5. Штативы для наконечников (например, "Axygen", США) и микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, "ИнтерЛабСервис", Россия).

6. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.

7. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

8. Ёмкость с крышкой для дезинфицирующего раствора.

При использовании комплектов реагентов "ПЦР-комплект" вариант 100-FRT F, "ПЦР-комплект" вариант 50-FRT F

1. Амплификатор роторного типа, например, "Rotor-Gene" 3000 или 6000 ("CorbettResearch", Австралия) или амплификатор планшетного типа, например, "iQ5" ("BioRad", США), "Мх3000Р" ("Stratagene", США) или эквивалентные.

2. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР:

а) на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные) (например, "Axygen", США) для постановки в ротор на 36 пробирок - для приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через дно пробирки (например, "Rotor-Gene").

б) на 0,2 мл (куполообразная крышка) (например, "Axygen", США) - для приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через крышку (например, "iQ5", "Мх3000Р").

6. Питательные среды и тест-культуры

6.1. Общие требования


При выполнении микробиологического анализа следует отдавать предпочтение стандартизованным сухим питательным средам промышленного производства. При использовании промышленных сухих питательных сред следует соблюдать способ приготовления, применения и сроки хранения, указанные изготовителем.

Вновь приобретенная партия питательных сред должна пройти контроль качества в соответствии с МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют дистиллированную воду, отвечающую требованиям ГОСТ 6709-72.

Питательные среды готовят в посуде из инертного материала.

6.2. Растворы для разбавлений и питательные среды

6.2.1. Солевой (физиологический) раствор


В 1 л дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлорида натрия, устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации рН=7,0±0,1. Разливают во флаконы, стерилизуют при температуре (120±2) °С 15 мин. Разливают мерно непосредственно перед посевом.

Срок хранения - до 1 месяца при комнатной температуре.

6.2.2. Пептонный раствор


В 1 л дистиллированной воды растворяют при кипячении 1 г пептона. Устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации рН=7,0±0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (120±2) °С 20 мин. Разливают мерно непосредственно перед посевом.

Срок хранения - до 1 месяца при комнатной температуре.

6.2.3. Пептонно-солевой раствор


В 1 л дистиллированной воды растворяют при кипячении 8,5 г хлорида натрия и 1 г пептона. Устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации рН=7,0±0,1. Стерилизуют при температуре (120±2) °С 20 мин. Разливают мерно непосредственно перед посевом.

Срок хранения - до 1 месяца при комнатной температуре.

6.2.4. Питательный бульон


Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному производителем.

6.2.5. Питательный агар


Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

Питательный агар не допускается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.

Питательный агар для определения колифагов прямым методом при посеве 20 мл пробы на чашку Петри готовят, увеличивая навеску сухого препарата на 10-15% от прописи. Разливают в емкости, автоклавируют при температуре (120±2) °С 20 мин.

Полужидкий питательный агар готовят с использованием одной трети навески сухого препарата, указанной на этикетке. Разливают в пробирки и автоклавируют при температуре (120±2) °С 20 мин.

Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры 45-49 °С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Срок хранения питательного агара со стрептомицином не более 2 недель. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.

6.2.6. Фуксин-сульфитная среда Эндо


Готовят из сухого препарата по способу, указанному производителем.

Готовую среду охлаждают до 60-70 °С и разливают в чашки Петри.

Если после застывания на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 3-5 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.

6.2.7. Лактозный агар с тергитолом-7 и ТТХ


Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Готовую среду охлаждают на водяной бане до 45-50 °С и добавляют приготовленного на стерильной дистиллированной воде 5 мл 0,05% водного раствора ТТХ на 100 мл основной среды. Хорошо перемешивают и разливают в чашки слоем не менее 5 мм. Раствор ТТХ и питательная среда устойчивы в течение недели при температуре 2-8 °С в защищенном от света месте.

6.2.8. Хромокульт колиформ агар


Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Нагревают на кипящей водяной бане, периодически помешивая, до полного растворения в течение 35 мин. Не автоклавировать, не перегревать. Готовую среду охлаждают до 45-50 °С и разливают в чашки Петри. Питательная среда устойчива в течение 2-х недель при температуре 2-8 °С в защищенном от света месте. Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

6.2.9. Лактозо-пептонная среда


Растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы. После растворения ингредиентов и остывания среды до комнатной температуры добавляют индикатор (2 мл 1,6%-го спиртового раствора бромтимолового синего), устанавливают рН (7,4-7,6), разливают по 10 мл в пробирки.

Для приготовления концентрированной лактозопептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

Готовую среду стерилизуют при (112±2) °С 12 мин.

6.2.10. Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу до кислоты и газа и образовывать индол

6.2.10.1 Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата


Готовят по способу, указанному производителем.

Срок хранения не более 2 недель при комнатной температуре. В холодильнике не хранить.

Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды "карманы" - потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

6.2.10.2. Жидкая лактозо-пептонная среда


Готовят в соответствии с п.6.2.9 с добавлением 1 мл 1,6%-го спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л среды, разливают по 3-5 мл в пробирки с поплавком или комочком ваты.

6.2.10.3. СИБ-лактоза


Готовят по прописи производителя.

Примечание. При выборе среды для подтверждения ферментации углеводов целесообразно использовать полужидкие среды, которые позволяют улавливать небольшое количество газа и на ранних стадиях ферментации, что повышает чувствительность метода и скорость получения ответа через 4-6 ч.

6.2.10.4. Лактозный бульон с борной кислотой


Растворяют в 1 л дистиллированной воды: 10 г пептона; 12,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (безводного); 4,1 г калия фосфорно-кислого однозамещенного (безводного); 3,2 г борной кислоты; 5 г лактозы. После растворения всех ингредиентов при нагревании, среду остужают до комнатной температуры и разливают по 5 мл в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют при (112±2) °С 12 мин. Срок хранения не более 2 недель.

Примечание. Каждую новую партию борной кислоты следует испытывать: при выращивании Е. coli при температуре 44 °С среда дает положительную реакцию - помутнение и газ.

6.2.10.5. Среда с триптофаном

10 г ферментативного пептона, 5 г хлористого натрия, 1 г триптофана растворяют в 1 л дистиллированной воды, устанавливают рН - 7,2, разливают в стерильные пробирки и автоклавируют при (120±2) °С в течение 20 мин.

6.2.11. Реактивы для оксидазного теста


Вариант 1.

Раствор 1%-й водный тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорида. Готовят перед употреблением.

Вариант 2.

Реактив N 1. Раствор 1%-й спиртовой МУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения-нафтола.

Реактив N 2. Раствор 1%-й водный диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида.

Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1-й - до одного месяца, 2-й - до одной недели. Перед употреблением к 2,5 частям первого раствора добавляют 7,5 частей второго раствора.

Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги).

Каждую новую партию и периодически раз в месяц реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens) и отрицательную (Е. coli) оксидазную реакцию.

Примечание: перечисленные реактивы являются канцерогенными. Работу по приготовлению реактивов следует выполнять в вытяжном шкафу, используя защитные перчатки и избегая контакта реактива с кожей.

6.2.12. Триптонный агар с желчью и Х-глюкуронидом


Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Разливают в емкости, стерилизуют при температуре (120±2) °С 15 мин. Готовую среду охлаждают до 45-50 °С и разливают в чашки Петри. Питательная среда устойчива в течение 4-х недель при температуре 2-8 °С в защищенном от света месте. Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

6.2.13. Реактив Ковача


Растворяют 5 г пара-диметиламинобензальдегида в 75 мл амилового спирта на водяной бане при 60 °С. Затем медленно добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты. Приблизительно через 6 ч, после изменения цвета, реактив готов для употребления. Цвет готового реактива должен быть от светло-желтого до светло-коричневого. При использовании некачественного амилового спирта реактив может приобрести темный цвет. Реактив следует хранить при температуре 4 °С в темном месте во флаконе из коричневого стекла. Срок хранения - две недели.

6.2.14. Щелочно-полимиксиновая среда (ЩЕС)

Ингредиенты

Обычная концентрация

Удвоенная концентрация

1. Мясопептонный бульон

70,0 мл

70,0 мл

Натрий хлористый

0,5 г

1,0 г

Глюкоза

1,0 г

2,0 г

Дрожжевой экстракт

2,0 мл (или 2 г)

4,0 мл (или 4 г)

2. Вода дистиллированная

15,0 мл

15,0 мл

Натрий углекислый

0,53 г

1,1 г

3. Вода дистиллированная

10,0 мл

10,0 мл

Натрий двууглекислый

0,25 г

0,5 г



Растворы 1, 2 и 3 стерилизуют раздельно при 112 °С 12 мин. После стерилизации растворы смешивают, проверяют рН (10,0-10,2), прибавляют 20000 единиц полимиксина М, 0,5 мл 1,6%-го спиртового раствора бромтимолового синего, разливают в пробирки по 5 мл. В среду удвоенной концентрации добавляют 40000 единиц полимиксина М и 1 мл бромтимолового синего. Разливают в колбы или флаконы по 10, 50 и 100 мл соответственно количеству исследуемой воды.

6.2.15. Приготовление молочно-ингибиторной среды (МИС)


Готовят 2,5%-й мясо-пептонный агар. К 85 мл готового питательного агара, охлажденного до температуры 40-45 °С, добавляют 15 мл стерильного обезжиренного (0,5%-й жирности) молока, 1,25 мл 0,01%-го водного раствора кристаллического фиолетового, 1 мл 2%-го водного раствора теллурита калия. Все хорошо смешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри.

6.2.16. Азидная среда Сланеца-Бертли


Сухой питательный агар промышленного производства готовят по указанию на этикетке, 4 г калия фосфорнокислого однозамещенного расплавляют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 7,0, разливают мерно в емкости, стерилизуют при (120±2) °С 20 мин.

Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар добавляют из расчета на 100 мл среды: дрожжевого экстракта - 2,0 мл, глюкозы - 1,0 г, азида натрия - 0,04 г, 1%-го водного раствора 2,-3,-5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) - 1 мл. Тщательно смешивают, разливают в чашки по 20-25 мл. Хранят в холодильнике не более 2 недель. Среду можно готовить перед употреблением без стерилизации в автоклаве.

6.2.17. Приготовление дрожжевого экстракта


Распределяют равномерно 1000 г прессованных (пекарских) дрожжей в 2000 мл дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100 °С 30 мин, отстаивают в холодильнике 4-5 суток. Надосадочную жидкость разливают во флаконы по 50-100 мл, на каждые 100 мл экстракта прибавляют 1,25 мл 0,01%-го водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают при 100 °С 30 мин. Хранят экстракт в холодильнике.

Можно применять сухой дрожжевой экстракт промышленного производства, уменьшив концентрацию в 10 раз от указанного в прописях сред.

6.2.18. Питательная среда для выделения энтерококков сухая - энтерококкагар


Готовят по прописи завода-изготовителя.

Навеску тщательно размешивают в 1 л воды дистиллированной, доводят до кипения и кипятят при постоянном помешивании в течение 1 минуты, быстро охлаждают до температуры 45-50 °С и разливают в чашки Петри. Минимальное время воздействия высокой температуры при приготовлении среды необходимо из-за наличия в среде ТТХ, который разлагается при нагревании.

6.2.19. Солевой агар с ТТХ для подтверждения наличия энтерококков


Сухой питательный агар по прописи производителя и 65 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды.

Осадок отфильтровывают, разливают мерно во флаконы, стерилизуют при (120±2) °С 20 мин. Перед употреблением в расплавленную основу из расчета на 100 мл добавляют: 1 г глюкозы, 2 мл дрожжевого экстракта или другого дрожжевого препарата, 1 мл водного 1%-го раствора ТТХ. Тщательно смешивают, разливают в чашки.

6.2.20. Желточно-солевой агар (ЖСА)


Сухой питательный агар по прописи производителя и 90 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, разливают мерно в емкости, стерилизуют при (120±2) °С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и остуженный до 50-55 °С солевой агар прибавляют один стерильно приготовленный яичный желток, тщательно смешанный с 50 мл физиологического раствора с помощью стеклянных бус, перемешивают и разливают в чашки Петри тонким слоем по 12-15 мл для подтверждающего этапа или толстым слоем по 20-25 мл для выращивания на мембранных фильтрах.

Допускается использовать сухой препарат промышленного производства (стафилококкагар) как солевую основу с последующим добавлением желточной взвеси.

6.2.21. Среда Мюллера-Кауфмана


В 500 мл исследуемой воды вносят 25 мл 10%-го пептона, 0,5 г желчных солей, 5 г кальция углекислого, 15 г натрия тиосульфата, 0,5 мл 0,1%-го водного раствора бриллиантового зеленого, 10 мл раствора Люголя. Для приготовления раствора Люголя в 10 мл воды вносят 3 г йода кристаллического и 2,5 г калия йодистого.

6.2.22. Приготовление желчной соли по Олькеницкому


К 1000 мл желчи крупного рогатого скота прибавляют 40 г натрия гидрата окиси, гидролизуют в автоклаве при 120 °С 3 ч или 2 раза по 2 ч в эмалированной или стеклянной посуде, исключая алюминиевую. После охлаждения в гидролизат прибавляют 100 мл 20%-го водного раствора бария хлористого и прогревают в автоклаве при 100 °С 1 ч. Через 18-24 ч отстаивания надосадочную жидкость сливают и фильтруют. К профильтрованному гидролизату прибавляют при постоянном помешивании 20%-й раствор соляной кислоты до кислой реакции (рН 6,4-6,6) и оставляют на 18-24 ч. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают водой, прибавляют при нагревании 40%-ный раствор натрия гидрата окиси до слабо щелочной реакции (рН 7,2-7,4) и выливают на противень для подсушивания в сушильном шкафу при 115 °С до порошкообразного состояния. Из 1000 мл желчи можно получить 36 г смеси желчных солей. Следует остерегаться перещелачивания при последней операции. Хранят соли в темной банке с притертой пробкой.

6.2.23. Селенитовая среда Лейфсона


Готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на упаковке.

Для приготовления селенитового бульона двойной концентрации увеличивают навеску сухого препарата в два раза на тот же объем дистиллированной воды.

6.2.24. Магниевая среда


Приготовление среды обычной и двойной концентрации.

Готовят раздельно растворы А, Б, В по нижеследующей прописи:

Растворы

Ингредиенты

Обычная концентрация на 1000 мл

Удвоенная концентрация на 100 мл

А

Пептон ферментативный

4,2 г

0,84 г

Натрий хлористый

7,0 г

1,4 г

Калий фосфорнокислый однозамещенный

1,5 г

0,3 г

Дрожжевой экстракт

20,0 мл

4,0 мл

Вода дистиллированная

890,0 мл

89,0 мл

Б

Магний хлористый кристаллический

36,0 г

7,2 г

Вода дистиллированная

90,0 мл

9,0 мл

В

Бриллиантовый зеленый 0,1%-й водный раствор

5,0 мл

1,0 мл



Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин, затем растворы А, Б и В сливают в одну колбу.

При исследовании больших объемов воды наилучшие результаты дает посев воды в магниевую среду по экспедиционной методике посева, заключающийся во внесении навесок и концентрированных растворов ингредиентов среды непосредственно в исследуемую воду в соответствии с нижеследующей прописью:

Ингредиенты

Объем исследуемой пробы воды

500 мл

100 мл

Магний хлористый кристаллический

19,5 г

3,9 г

Натрий хлористый

4,0 г

0,8 г

Калий фосфорно-кислый однозамещенный безводный

0,8 г

0,16 г

10%-й раствор пептона

25,0 мл

5,0 мл

Дрожжевой экстракт

11,0 мл

2,5 мл

Бриллиантовый зеленый 0,1%-й водный раствор

2,5 мл

0,5 мл



Каждую навеску ингредиента вносят в исследуемый объем воды по одному после полного растворения предыдущего сразу после внесения.

Все навески можно заранее соединить в одной емкости в виде жидкой кашицы. Через 24 ч хранения при комнатной температуре происходит стерилизация концентрата. Дополнительная стерилизация не требуется.

6.2.25. Питательная среда для сальмонелл РСН


Готовая к применению, производства Ростов НИИ МИ Роспотребнадзора (г.Ростов-на-Дону).

6.2.26. Тетратионатная среда накопления по Preuss


К 1000 мл мясопептонного бульона добавляют 5 мл 0,1%-го водного раствора кристаллического фиолетового, стерилизуют при (112±2)° С 12 мин. После охлаждения добавляют 20 г тетратионата калия, устанавливают рН 6,5. Среду разливают в стерильные емкости размера, необходимого для последующего посева. Срок хранения - до одной недели при температуре 4 °С.

6.2.27. Висмут-сульфит агар


Готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на этикетке. Разливают в стерильные чашки Петри. Среду готовят заранее. До посева чашки со средой выдерживают в холодильнике не менее 24 ч.

6.2.28. Агар ЭМС (агар с эозиновым метиленовым синим)


Готовят из сухого препарата промышленного производства по прописи производителя.

6.2.29. Бактоагар Плоскирева с антибиотиками


Готовят из сухого препарата промышленного производства по прописи производителя.

6.2.30. Коммерческая среда ЕС-бульон (селективная) для обнаружения и определения количества бактерий Е. coli


Способ приготовления среды согласно прописи производителя.

6.2.31. Основа бульона для накопления кампилобактерий (Престона) HiMedia М 899 и (Дойла) HiMedia M 916


Используют готовую среду согласно прописи на этикетке. Растворяют сухую основу порошка в дистиллированной воде. При необходимости производят подогрев среды до кипения для полного растворения частиц. Стерилизация в автоклаве при температуре 121 °С в течение 15 мин. Остудить до температуры 45 °С.

Приготовление полной среды: перед использованием в 500 мл бульона асептически добавить 35 мл стерильной дефибринированной крови барана или древесный уголь, а также растворенное в этаноле содержимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков модифицированной III (по Дойлу). Тщательно перемешать и разлить в соответствующие емкости в количествах, необходимых для проведения исследования.

6.2.32. Селективный агар Престона

Состав основы среды:

Пептон

10,0 г

Мясной экстракт

10,0 г

Натрия хлорид

5,0 г

Агар-агар

12,0 г

Вода дистиллированная

1000,0 мл

рН (при 25 °С)

7,5±0,2


Растворить основные компоненты в дистиллированной воде. При необходимости довести до кипения для полного растворения частиц. Установить рН 7,5±0,2 с помощью 0,1 н НСl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. Остудить до 45-50 °С.

Приготовление полной среды: перед использованием в 1000 мл расплавленного и остуженного до 45-50 °С агара асептически добавить 70 мл стерильной дефибринированной крови барана; растворенное в 50%-м растворе ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков для кампилобактерий IV (по Престону) или I (по Блейзер-Вонг), или растворенное в 50%-м растворе этанола содержимое двух флакончиков с селективной ростовой добавкой для кампилобактерий, или 4 мл аэротолерантной добавки, тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-5 мм.

6.2.33. Питательная среда для культивирования кампилобактерий, сухая - кампилобакагар

40 г сухой среды размешать в 1 л дистиллированной воды, довести до кипения и кипятить 2-3 мин до полного растворения. Среду разлить по 400 мл в колбы и стерилизовать автоклавированием 20 мин при 121 °С. В остуженную до 50-55 °С питательную основу среды вносят FBP-добавки и 20 мл бараньей или донорской крови и разливают в чашки Петри по 15-20 мл. Для придания среде селективных свойств используют селективные смеси.

Примечание.

Добавки для повышения аэротолерантности (FBP-добавки)

1. FBP-добавки: указанное количество добавок рассчитано на 1 л питательной среды.

Железа сульфат II

0,25 г

Натрий сернисто-кислый пиро(метабисульфит)

0,25 г

Натрий пировиноградно-кислый (пируват)

0,25 г


Навески солей внести в сухую стерильную пробирку, добавить 5 мл стерильной дистиллированной воды, периодически встряхивать в течение 15-20 мин. Приготовленный раствор имеет оливковый цвет, не подлежит хранению и должен быть использован в день приготовления.

2. Прописи селективных добавок к питательным средам.

N п/п

Состав

Концентрация препаратов, мг/л

Авторы

1

Рифампицин

20

Инструкция по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза, 1989

Фузидин

10

Амфотерицин В

3

Цефалотин

15

2

Цефаперазон

30

Goossens H. etal., 1989

Триметоприм

50

3

Полимиксин В

2

Рифампицин

10

Ристомицин

10

Амфотерицин В

2

Фузидин

2

4

Полимиксин В

2

Матвеева З.Н., 1989

Рифампицин

10

Ристомицин

10

Амфотерицин В

3

5

Цефалексин

30

Иванов В.П. и др., 1991

Рифампицин

10

Триметоприм

5

Амфотерицин В

2

6

Цефалексин

30

Иванов В.П. и др., 1991

Рифампицин

10

Этазол-натрий

250

Амфотерицин В

2


6.2.34. Питательные среды обогащения для выделения Pseudomonas aeruginosa

а) Минеральная среда Бонде нормальной концентрации

Трехзамещенный фосфат натрия

0,28 г

Фосфат натрий-аммония

0,15 г

Однозамещенный фосфат калия

0,1 г

Сульфат магния

0,02 г

Дистиллированной воды

до 100,0 мл.


Стерилизация при 1 атм. в течение 20 мин. Непосредственно перед посевом прибавить 2,0 мл 0,01%-го водного раствора кристаллического фиолетового.

б) Концентрат среды Бонде

Все компоненты, кроме воды, добавляют в 10-кратном размере. Концентрат прибавляется к объекту в соотношении 1:10.

в) Среда с хлоридом трифенилтетразола (ТТХ)

Пептон

2,0 г

Дрожжевой экстракт (из пекарских дрожжей)

15,0 мл

или сухого

0,3 г

Двузамещенный фосфат калия

0,2 г

ТТХ

0,8 г

Вода дистиллированная

до 100,0 мл.


Стерилизация при 0,5 атм. в течение 15 мин.

г) 10%-й водный раствор ТТХ в дистиллированной воде

6.2.35. Селективно-дифференциальная среда второго этапа - среда "Блеск"

Мясопептонный стерильный агар 2%

100 мл

Молоко нормализованное стерильное

10,0 мл

10%-й водный раствор ТТХ

8,0 мл

L-аргинин гидрохлорид

0,3 г.


В расплавленный МПА прибавить аргинин, раствор ТТХ (самостерилизуется после хранения при комнатной температуре в течение 2-3 дней) и стерильное снятое молоко. Все размешать и разлить в 6-7 чашек Петри.

При отсутствии мясопептонного агара возможно применение упрощенного варианта среды "Блеск":

Вода дистиллированная

100,0 мл

Сухой питательный агар

по прописи на этикетке.


Стерилизовать при 0,5 атм. в течение 15 мин.

Внести:

стерильного снятого молока

10,0 мл

10%-го водного раствора ТТХ

8,0 мл


Смешать и разлить в 6-7 чашек Петри.

6.2.36. Среда Кинг-А

Пептон

2,0 г

Агар

1,5 г

Глицерин

1,0 г

Сульфат калия

1,0 г

Хлорид магния

0,14 г

Вода дистиллированная

до 100 мл

РН среды

7,2


Стерилизация при 0,5 атм. в течение 15 мин. Разлить в 6-7 чашек Петри.

6.2.37. Среда для определения оксидации мальтозы

Пептон

0,2 г

Агар

1,5 г

Хлорид натрия

0,5 г

Мальтоза

2,0 г

1,6%-й спиртовой или щелочной раствор бромтимолового синего

1,0 мл

Вода дистиллированная

до 100 мл

РН среды

7,2


Стерилизация при 0,5 атм. в течение 15 мин. Разлить в 6 чашек Петри.

6.2.38. Среда для определения теста Хью и Лейфсона (оксидация, ферментация глюкозы)

Модификация в одной пробирке.

Пептон ферментативный

2,0 г

Хлорид натрия

5,0 г

Глюкоза

5,0 г

KМУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населенияНРОМУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения

0,3 г

Агар-агар

4-6 г

1,6% раствор фенолового красного

2,5 мл

Вода дистиллированная

1000 мл.


После растворения всех ингредиентов на водяной бане или автоклаве разлить в пробирки высотой столбика 6 см (независимо от диаметра пробирки), стерилизовать при 0,5 атм. в течение 15 мин, остудить столбиком.

6.2.39. Тест Грегерсена


Простой, быстрый способ, заменяющий окраску по Граму и не требующий оптики.

В капле 3% водного раствора KОН на предметном стекле эмульгируют бактериальную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду бактерий. У грамположительных бактерий, за редкими исключениями, реакция отрицательна.

6.2.40. Тест-системы


Набор для выделения РНК, например, типа "Рибозоль".

Тест-система для определения РНК энтеровирусов.

Тест-система для определения РНК вируса гепатита А.

6.2.41. Тест-культуры микроорганизмов


Контрольный колифаг MS-2, штамм ВКПМ РН 1505, штамм ВКПМ-3254 Escherichia coli K12F+Str-r, Escherichia coli штамм 675, Staphylococcus aureus штамм 906 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosae 10145 АТСС или Pseudomonas fluorescens 948 АТСС, тест-штамм Campylobacter jejuni.

7. Внутренний контроль качества микробиологических исследований


Комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на обеспечение и контроль стабильности требуемых условий роста микроорганизмов, ведения эталонных бактериальных культур, а также предупреждения неблагоприятного воздействия факторов, возникающих в процессе выполнения анализа и оценки его результатов, изложены в МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологического исследования воды".

8. Подготовка посуды и материалов

8.1. Общие требования к подготовке лабораторной посуды для анализа


Посуда, применяемая для микробиологического анализа (пробирки, колбы, флаконы), должна быть удобной конструкции, использоваться должным образом и проходить соответствующую подготовку, чтобы гарантировать и чистоту, и стерильность.

После окончания анализа использованную лабораторную посуду с содержимым обеззараживают автоклавированием при температуре (126±2) °С (0,15 МПа) в течение 60 мин с момента достижения указанной температуры в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08.

После автоклавирования лабораторную посуду многократного применения моют с использованием моющих средств, не содержащих фосфаты, после чего тщательно промывают проточной водопроводной водой до полного удаления моющего средства, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Использованные пипетки погружают в рабочий раствор дезинфекционного средства. Через 30-60 мин после обеззараживания пипетки тщательно промывают проточной водопроводной водой до полного удаления дезинфицирующего средства, после чего промывают дистиллированной водой и высушивают.

После высушивания чашки Петри, пробирки, пипетки укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.

Лабораторная посуда для вирусологических исследований должна быть химически чистой, хорошо обезжирена, тщательно вымыта до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей, высушена и простерилизована.

Стерилизацию посуды сухим жаром проводят в суховоздушном шкафу одним из способов:

- при температуре (180±3) °С в течение 1 ч с момента достижения указанной температуры;

- при температуре (160±5) °С в течение 2,5 ч с момента достижения указанной температуры.

Стерилизацию посуды в автоклаве осуществляют:

- при температуре (126±1) °С (0,15) МПа в течение (10±1) мин с момента достижения указанной температуры;

- при температуре (120±2) °С (0,11) МПа в течение (45±3) мин с момента достижения указанной температуры.

После окончания стерилизации посуда маркируется с указанием даты стерилизации. Срок хранения стерильной посуды (чашки Петри, пробирки, пипетки), укупоренной в бумагу или металлические пеналы, составляет не более 30 дней.

8.2. Требования к емкостям для отбора проб


Подготовка, стерилизация, материалы для изготовления емкостей приведены в ГОСТ Р 53415-2009. Вся посуда для отбора проб на санитарно-бактериологические и вирусологические исследования должна быть стерильной и изготовлена из материалов, не влияющих на жизнедеятельность, и не оказывающих инактивирующего действия на микроорганизмы и обеспечивающих неизменность состава пробы.

При отборе проб воды для бактериологических исследований используют чистые стерильные бутыли из стекла для многократного применения или из полимерного материала как одноразовые.

Горловины бутылей должны быть укомплектованы плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми, пластмассовыми, закрывающиеся нажатием или завинчивающимися крышками), защищены снаружи от загрязнений колпачками из алюминиевой фольги или плотной бумаги, которые не должны разрушаться при стерилизации.

Не допускается применение ватных пробок, так как при длительном воздействии высоких температур в условиях стерилизации вата может выделять токсичные вещества, влияющие на результаты анализа.

Для отбора проб путем погружения в чистые воды используют бутыли, которые должны быть стерильными как внутри, так и снаружи, и защищены от загрязнений при хранении после стерилизации, например, упакованы в плотную бумагу.

Вместимость бутыли для отбора проб должна соответствовать объему воды, необходимому для определения всех требуемых микробиологических показателей:

- для определения 4-5 индикаторных микроорганизмов - не менее 500 смМУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения;

Доступ к полной версии этого документа ограничен

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

Что вы получите:

После завершения процесса оплаты вы получите доступ к полному тексту документа, возможность сохранить его в формате .pdf, а также копию документа на свой e-mail. На мобильный телефон придет подтверждение оплаты.

При возникновении проблем свяжитесь с нами по адресу uwt@kodeks.ru

МУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения

Название документа: МУК 4.2.2959-11 Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения

Номер документа: 4.2.2959-11

Вид документа: МУК (Методические указания по методам контроля)

Принявший орган: Главный государственный санитарный врач РФ

Статус: Действующий

Опубликован: М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 год

официальное издание

Дата принятия: 29 июля 2011

Дата начала действия: 29 июля 2011
Информация о данном документе содержится в профессиональных справочных системах «Кодекс» и «Техэксперт»
Узнать больше о системах