МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ (ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ,
ВОДЕ, СТОЧНЫХ ЖИДКОСТЯХ)

Методические рекомендации разработаны сотрудниками Московского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (Г.П.Калина, Г.М.Трухина, Н.Б.Комзолова, Т.И.Графова).

Ответственный редактор - академик АМН СССР А.П.Шицкова.

Рассмотрены Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР и рекомендованы к утверждению для внедрения в практику лабораторий НИИ и для использования по показаниям в бактериологических лабораториях республиканских, краевых, областных санэпидстанций.

УТВЕРЖДЕНЫ Начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР В.П.Сергиевым 24 мая 1984 г.

Введение

В последние годы возрастает значение Ps. aeruginosa в патологии человека. Обнаружение Ps. aeruginosa в объектах окружающей среды сигнализирует одновременно об эпидемическом (как патоген) и санитарном (как индикатор биологического загрязнения) неблагополучии. Известны острые кишечные инфекции псевдомонадной этиологии водного происхождения и различные формы заболеваний (отиты, поражения кожного покрова) у купающихся в бассейнах, септические заболевания грудных детей с летальным исходом в результате купания в питьевой воде централизованного водоснабжения, содержавшей Ps. aeruginosa.

Описаны вспышки пищевых токсикоинфекций псевдомонадной этиологии и обнаружение Ps. aeruginosa в пищевых продуктах, особенно богатых белками (мясо, рыба), что характеризует последние как возможный источник пищевой токсикоинфекции. Острые кишечные инфекции псевдомонадной этиологии клинически протекают в виде диаррей той или иной тяжести, особенно тяжело у детей, пожилых людей и больных хроническими заболеваниями, а при пищевых токсикоинфекциях - со всеми признаками этиопатогенеза этого типа заболеваний.

В то же время, в природе существует до 200 видов псевдомонад - сапрофитов или фитопаразитов, не представляющих медицинский или санитарный интерес, и широкое применение простых надежных способов отличия Ps. aeruginosa от этих видов приобретает большое практическое значение.

Настоящие методические рекомендации предназначены для использования в практике бактериологических лабораторий гигиенического и эпидемиологического профиля и распространяются на объекты окружающей среды - пищевые продукты, воду централизованного снабжения и водоемов, используемых в качестве источников централизованного, хозяйственно-питьевого водоснабжения или для рекреационных целей (плавательные бассейны, бани, прибрежные воды курортных мест, минеральные воды, используемые для питья и лечебных процедур, смывы с посуды, инвентаря и рук персонала общественного питания).

Методические рекомендации не распространяются на патологический материал при внутрибольничных инфекциях и на предметы окружения больных, воздух больничных помещений, лекарственные средства, методы исследования которых на Ps. aeruginosa существенно отличаются от методов, применяемых при исследованиях окружающей среды. Разница методических приемов определяется:

а) необходимостью при исследованиях окружающей среды использовать преимущественно предварительное накопление Ps. aeruginosa в самом исследуемом материале или среде накопления, в то время, как при исследованиях патологического материала и предметов окружения больных применяют, как правило, непосредственный посев на плотные селективно-дифференциальные среды;

б) малой результативностью сред, эффективность которых доказана при исследованиях патологического материала, при использовании применительно к объектам окружающей среды;

в) различиями Ps. aeruginosa, обнаруживаемых в объектах окружающей среды, от выделяемых из патологического материала и окружения больных, по большей стабильности культуральных, биологических и биохимических свойств, меньшей частоте утраты пигмента феназина (смеси пигментов цианина, рубрина, меланина), в результате чего идентификация штаммов Ps. aeruginosa, выделяемых из объектов окружающей среды, значительно упрощается.

Предлагаемая схема исследования и идентификации Ps. aeruginosa применительно к объектам окружающей среды впервые разработана в СССР, а за рубежом имеются лишь отдельные рекомендации или стандартные методы исследования отдельных объектов - воды, пищевых продуктов, почвы, без объединения в общую универсальную сводку методических приемов.

1. Лабораторное оборудование, реактивы, материалы

1.1. Лабораторное оборудование

1.1.1. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. ГОСТ 25336-82 (СТ СЭВ 2945-81).

1.1.2. Проволока из никелевого и медноникелевых сплавов для удлиняющих проводов к термоэлектрическим преобразователям. ГОСТ 1791-67.

1.2. Основы питательных сред.

1.2.1. Агар микробиологический. ГОСТ 17206-71*.

_______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 17206-96. - Примечание изготовителя базы данных.

1.2.2. Дрожжи хлебопекарные прессованные. ГОСТ 171-81.

1.2.3. Молоко коровье пастеризованное. ГОСТ 13277-79*.

_______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52090-2003. - Примечание изготовителя базы данных.

1.2.4. Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. ГОСТ 13805-76.

1.3. Реактивы.

1.3.1. Альфа нафтол. ГОСТ 5838-79.

1.3.2. Диметил-пара-фенилондиамин. ТУ 6-09-18-28-72.

1.3.3. Калия гидроокись. ГОСТ 24363-80.

1.3.4. Карбонат кальция. ГОСТ 4530-76.

1.3.5. Калий азотнокислый. ГОСТ 4144-79.

1.3.6. Калий сернокислый. ГОСТ 4145-74.

1.3.7. Магний сернокислый 7-водный. ГОСТ 4523-77.

1.3.8. 2-, 3-, 5-трифенилтетразол хлористый. ТУ 6-09-3838-74.

1.3.9. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. ГОСТ 2493-75.

1.3.10. Натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный 4-водный. ТУ 4170-78.

1.3.11. Магний хлористый, 6-водный. ГОСТ 4209-77.

1.3.12. Натрий хлористый. ГОСТ 4233-77.

1.3.13. * -аргинин гидрохлорид. ТУ 6-09-2100-72.

________________

* Соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

1.3.14. Натрий лимоннокислый трехзамещенный. ГОСТ 22280-76.

1.4. Углеводы и спирты.

1.4.1. Глицерин. ГОСТ 6824-76.

_______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 6824-96. - Примечание изготовителя базы данных.

1.4.2. Д-глюкоза. ГОСТ 6038-79.

1.4.3. Ксилоза. ТУ 6-09-20-45-77.

1.4.4. Мальтоза. ВТУ 257-59.

1.5. Красители, индикаторы.

1.5.1. Бромтимоловый синий. ТУ 6-09-2045-77.

1.5.2. Кристаллический фиолетовый. ТУ 6-09-4119-75.

1.5.3. Феноловый красный. ГОСТ 4599-73.

2. Питательные среды

2.1. Питательные среды обогащения первого этапа. Различны в зависимости от исследуемого объекта, их выбор определяется уровнем и составом усвояемых компонентов в исследуемом объекте.

2.1.2. Минеральная среда Бонде (модификация). Трехзамещенного цитрата натрия 0,28 г, фосфата натрий-аммония 0,15 г, однозамещенного фосфата калия 0,1 г, сульфата магния 0,02 г, дист. воды до 100,0 мл. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Непосредственно перед посевом прибавить 2,0 мл 0,01% водного р-ра кристаллического фиолетового.

2.1.2. Концентрат среды Бонде. Все компоненты, кроме воды в 10-кратном размере. Концентрат прибавлять к объекту в соотношении 1:10.

2.1.3. Среда с хлоридом трифенилтетразола (ТТХ): пептона 2,0 г, дрожжевого экстракта по Г.Г.Калине* 15 мл (или сухого 0,3 г, двузамещенного фосфата калия 0,2 г, ТТХ 0,8 г, воды дист. до 100,0 мл. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, рН 7,1.

2.1.4. Дрожжевой экстракт жидкий по Г.Г.Калине*.

________________

* Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов. МЗ СССР, М., 1981 г.

2.1.5. 8% водный раствор ТТХ в дистиллированной воде. В жидкие объекты прибавляют в соотношении 1:10.

2.2. Селективно-дифференциальная среда (СДС) второго этапа.

2.2.1. Среда "Блеск". Мясопептонного стерильного 2% агара 100,0 мл, молока нормализованного 10,0 мл, 10% водного раствора трифенилтетразола хлорида 8,0 мл, L-аргинина гидрохлорида 0,3 г, в расплавленный мясопептонный агар прибавить аргинин, р-р трифенилтетразол хлорида (самостерилизуется после хранения при комнатной температуре 2-3 дня) и стерильное снятое молоко размешать, разлить в 6-7 чашек.

2.2.2. При отсутствии мясопептонного агара возможно применение упрощенного варианта среды "блеск": к 100,0 мл дистиллированной воды прибавить питательный сухой агар Дагестанского НИИ питательных сред, после стерилизации при 0,5 атм., 15 мин, внести 10,0 мл стерильного снятого молока и 8,0 мл 10% водного р-ра трифенилтетразола хлорида, смешать, разлить в 6-7 чашек. Следует учесть, что такая упрощенная среда несколько теряет в интенсивности образования блеска (вместо сплошного золотистого налета колонии содержат мелкие золотистые вкрапления или ободок по периметру колонии).

2.3. Среды и тесты идентификации.

2.3.1. Среда Кинг-А. Пептон 2,0 г, агар 1,5 г, глицерин - 1,0 г, сульфат калия 1,0 г, хлорид магния 0,14 г, вода дистиллированная до 100,0 мл рН 7,2. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, разлить в 6 чашек.

2.3.3. Среда для определения оксидации мальтозы. Пептон 0,2 г, хлорид натрия 0,5 г, мальтоза 2,0 г, 1,6% спиртовой или щелочной раствор бромтимолового синего 1,0 мл, вода дистиллированная до 100,0 мл рН 7,2. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, разлить в 6 чашек.

2.3.4. Среда для определения теста Хью и Лейфсона (оксидация, ферментация). Модификация в одной пробирке. Пептон 2,0 г, хлорид натрия 5,0 г, глюкоза 5,0 г, KHPO 0,3 г, агар - 4,0-6,0 г, 1,6% р-р фенолового красного 2,5 мл, вода 1000,0 мл. После растворения в водяной бане или автоклаве разлить в пробирки ровно высотой столбика 6 см (независимо от диаметра пробирки), стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин, застудить столбиком.

2.3.5. Среда для определения нитрат-нитритредуктазы и роста при 42 °С. Пептон 2,0 г, хлорид натрия 0,5 г, нитрат калия 0,2 г, агар 0,1 г, дрожжевой экстракт жидкий 20,0 мл, вода 80,0 мл (дрожжевой экстракт и вода могут быть заменены мясопептонным бульоном, в этом случае содержание пептона уменьшить до 1,0 г). После растворения компонентов в водяной бане разлить в пробирки по 4-5 мл, стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин, застудить столбиком.

2.3.6. Реакция цитохромоксидазы по Гэби и Хедли. В СССР принят метод определения цитохромоксидазы с использованием диметилпарафенилендиамина (пара-аминодиме.....*аланина хлорида или оксалата), который в сочетании с альфанафтолом образует за счет оксидации цитохрома индофеноловый синий. 1% водный раствор реактива смешать с 1% спиртовым раствором альфа-нафтола в пропорции 2:1 непосредственно перед применением. Хранение обоих реактивов обязательно раздельно в холодильнике. Смесь реактивов наносят петлей (платиновой или нихромной, но не железной) на периферический участок макроколонии на среде Кинг-А или на изолированную колонию на среде "блеск". Пигментированные колонии на среде Кинг-А и покрытые золотистым налетом на среде "блеск" предпочтительно наносить на фильтровальную бумагу, смоченную смесью реактивов. Положительный результат - посинение колонии или мазка на фильтровальной бумаге в течение 20-40 секунд. Позднюю реакцию, как и посинение агаровой среды, не учитывать.

________________

* Брак оригинала. - Примечание изготовителя базы данных.

2.3.7. Тест Грегерсена. Простой, быстрый способ, заменяющий окраску по Граму и не требующий оптики. В капле 3% водного р-ра KОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грам-отрицательному виду. У грам-положительных микробов, за редкими исключениями, реакция отрицательна.

3. Отбор проб

3.1. Вода питьевая.

3.1.1. Пробы воды поверхностных водоемов (водохранилищ, проточной речной, прудовой, озерной, плавательных бассейнов, рекреационных биотопов) отбирают в количестве 500,0 мл.*

3.1.2. Пробы воды централизованного водоснабжения (водопроводной) после очистки и хлорирования отбирают в количестве 1000,0 мл* со следующими изменениями и дополнениями в соответствии со спецификой:

а) воду из крана отбирают двукратно, сразу после открывания крана и после спуска воды в течение 10-15 мин; б) к исследуемой воде дехлоратор не прибавляют.

________________

* ГОСТ 18963-73 "Методы санитарно-бактериологического анализа".

3.1.3. Пробы грунтовой и артезианской воды отбирают в количестве 500,0 мл, руководствуясь в основном п.3.1.2.