МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия)

Дата введения 2004-03-01

1. РАЗРАБОТАНЫ: Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (Брагина И.В., Кривопалова Н.С., Минаева Н.А., Белобородова O.К.), Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии (Котляров В.М., Фирсова Т.Е., Чевелева С.С.), МУП "Уфаводоканал" (Кантор Л.И., Труханова Н.В., Майтова Р.Ф.), центром Госсанэпиднадзора в Южном Административном округе г.Москвы (Митрофанова Т.А., Чернявский Г.И., Гудков А.А.), фирмой "Лаб-БиоМед", (Соколов Д.М., Кашинцев И.В.).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главным врачом Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н.Беляевым 10.02.2004 г. N 24ФЦ/513.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

     
     Раздел 1. Определение колиформных бактерий и E.coli в пищевых продуктах, продовольственном сырье; смывах с объектов внешней среды

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных исследований по ускоренному определению и выявлению колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред в образцах пищевых продуктов (кроме кисломолочных продуктов, заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочнокислых бактерий), продовольственного сырья; смывов с объектов внешней среды.

1.2. Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании*, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.

________________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Утратило силу на основании постановления Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 года N 569, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.   

1.3. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологической службы федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих государственный и ведомственный контроль; в лабораториях организаций, осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения указанных испытаний.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон РФ "О защите прав потребителей" от 7 февраля 1992 г.

2.3. Закон РФ "О качестве и безопасности пищевых продуктов" N 29-ФЗ от 2 января 2000 г.

2.4. "Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.5. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.6. СП 1.2.731-99* Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами.

________________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют СП 1.3.2322-08, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

2.7. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований.

2.8. СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

2.9. СанПиН 2.3.2.1280-03 Дополнения и изменения N 2 к СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.

2.10. ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов.

2.11. ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.

2.12. ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.

2.13. ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).

2.14. ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида E.coli.

2.15. ИСО 16649*. Количественное определение Escherichia coli в пищевых продуктах и кормах.

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

2.16. ГОСТ 19569-89* Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.

________________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 31598-2012, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

2.17. ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.

2.18. ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

2.19. ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.

2.20. ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

2.21. ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия.

3. Требования к помещениям и технике безопасности

Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны соответствовать требованиям СП 1.2.731-99, ГОСТ Р 51446.

4. Аппаратура, материалы, питательные среды*

________________

* Производство питательных сред компании Merck KGaA (Германия) имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.

5. Принцип действия хромогенных и флюорогенных питательных сред

Селективные хромогенные и флюорогенные индикаторные среды предназначены для ускоренного одновременного определения общих колиформных бактерий и E.coli в исследуемом образце.

Принцип действия хромогенных и флюорогенных сред основан на выявлении специфических ферментов - -галактозидазы колиформных бактерий; -глюкуронидазы и триптофаназы E.coli.

Специфическая активность ферментов проявляется в результате расщепления хромогенных и флюорогенных субстратов, входящих в состав индикаторных сред, с образованием флюоресцирующих или имеющих окраску продуктов, которые изменяют цвет (вызывают флюоресценцию) жидких сред или характерно окрашивают колонии на агаризованных средах.

На среде Fluorocult LMX Broth -галактозидаза колиформных бактерий расщепляет хромогенный субстрат (X-GAL*) с образованием окрашенного продукта, который изменяет цвет среды со светло-желтого на сине-зеленый. Фермент -глюкуронидаза E.coli расщепляет флюорогенный субстрат (MUG*) с образованием флюоресцирующего (при воздействии УФ-света) продукта.

________________

* Производство питательных сред компании Merck KGaA (Германия) имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.

На средах Chromocult Coliform Agar и Chromocult Coliform Agar ES -галактозидаза колиформных бактерий расщепляет хромогенный субстрат (Salmon-GAL*) с образованием хромогенного продукта, который окрашивает колонии в розовый (до красного) цвет. Ферменты -галактозидаза и -глюкуронидаза E.coli расщепляют хромогенные субстраты (Salmon-GAL и X-GLUC*) с образованием хромогенных продуктов, которые окрашивают колонии в темно-синий (до фиолетового) цвет.

________________

* См. состав питательных сред.

Фермент триптофаназа выявляется при расщеплении триптофана, включенного в состав сред Fluorocult LMX Broth и Chromocult Coliform Agar, с подтверждением образования индола реактивом Ковача.

Для целей настоящих MP применяются следующие определения:

Колиформные бактерии - микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae, характеризующиеся наличием фермента -галактозидазы, способного расщеплять специфические хромогенные субстраты, входящие в состав селективных индикаторных сред.

E.coIi - колиформные бактерии, характеризующиеся наличием фермента -глюкуронидазы, способного расщеплять специфические хромогенные или флюорогенные субстраты, входящие в состав селективных индикаторных сред, и фермента триптофаназы, расщепляющей триптофан.

Входящие в состав индикаторных сред качественные пептоны и фосфатный буфер обеспечивают оптимальные условия роста колиформных бактерий; триптофан дает возможность проведения индольного теста для окончательного подтверждения E.coli; пируват натрия восстанавливает поврежденные клетки колиформных бактерий и повышает чувствительность метода. Селективные агенты (лаурилсульфат натрия, тергитол 7, соли желчных кислот и пропионовая кислота) ингибируют рост сопутствующей микрофлоры.

Метод одновременного определения колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных питательных сред является высокочувствительным, специфичным, позволяет сократить время исследования до 24 часов.

6. Сущность методов

6.1. Метод выявления колиформных бактерий и E.coli основан на высеве определенного количества исследуемого образца или его разведений в жидкие селективные хромогенные среды; инкубировании посевов; учете изменения цвета и флюоресценции среды с образцами; подтверждении образования индола для E.coli.

6.2. Метод определения количества колиформных бактерий и E.coli основан на высеве определенного количества образца или его разведений на агаризованные хромогенные селективные среды; инкубировании посевов; выявлении и подсчете характерно окрашенных колоний.

7. Отбор и подготовка проб