Об утверждении Методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения (с изменениями на 22 декабря 2016 года)
6. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для рыб
Рыбы (наряду с водными млекопитающими) находятся в области конечного звена трофической цепи водных экосистем и включают две трофические группы - мирных и хищных видов рыб, из которых хищники занимают высшее звено по сравнению с мирными.
Определение ПДК веществ на ранних стадиях эмбриогенеза и на взрослых рыбах важно с двух точек зрения - установления опасности вещества для существования популяции рыб в водном объекте и угрозы здоровью человека при употреблении их в пищу.
Эти особенности рыб учитываются при выборе тест-объектов, установлении параметров и критериев токсичности, кумулятивных свойств, патологических изменений и отдаленных последствий действия исследуемых веществ.
Для определения наиболее чувствительных (уязвимых) звеньев среди разных групп рыб параметры токсичности следует определять на наиболее чувствительных к веществу видах и возрастных группах, кумулятивные эффекты и поиск наиболее чувствительных физиолого-биохимических показателей - на средне- и малочувствительных.
Выделяют три группы рыб, обладающих разной чувствительностью по отношению к большому числу токсических веществ:
а) высокочувствительные - все виды лососевых, а также голец, судак, плотва, пескарь, верховка;
б) среднечувствительные - голавль (возраст 1+), гольян, лещ, окунь, красноперка;
в) малочувствительные - голавль (возраст 2+ и старше), карп, карась.
Целесообразно использовать виды рыб, широко распространенные в местных водных объектах и хорошо переносящие содержание в лабораторных условиях.
6.1. Эмбрионы и личинки рыб
6.1.1. Вводные замечания
Контролируются эмбриональное развитие рыб в исследуемой воде, выклев свободных эмбрионов (предличинок) и выживаемость предличинок после выклева. Из литературных источников и из опыта нормирования известно, что эмбрионы рыб и предличинки более чувствительны к токсическому воздействию по сравнению со взрослыми особями.
В настоящих Методических указаниях описан порядок работы с аквариумной рыбкой данио рерио, но наряду с этим видом могут быть использованы вьюн, осетр, форель и др.
6.1.2. Характеристика тест-объекта
В качестве тест-объекта для определения ПДК вещества по эмбриональному развитию удобно использовать икромечущую аквариумную рыбу данио Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), поскольку материал для исследования можно получать в течение всего года, независимо от периодичности работы рыбоводных заводов. В природе данио обитает в медленно текущих водных объектах Юго-Восточной Азии. Длина взрослых рыб до 4,5 см. Тело цилиндрической формы, серебристое с 7-9 темно-синими горизонтальными полосами. Полосы идут к хвостовому и анальному плавникам. Спина окрашена в оливково-зеленый цвет.
6.1.3. Условия лабораторного содержания
Для содержания рыб-производителей могут быть использованы аквариумы объемом от 25 дм, заполненные отстоянной водопроводной водой с температурой 22°С. Для кормления может быть использован сухой корм, но при подготовке к нересту необходимы живые корма (дафния, циклоп, мотыль, отмытый трубочник).
Для получения икры самок и самцов отделяют друг от друга и кормят живым кормом. Плотность посадки рыб в этот период не отличается от обычного содержания. В конце второй недели самцы приобретают густой золотистый блеск, а брюшко самок значительно увеличивается в объеме за счет икры. Наиболее подготовленных к нересту рыб отлавливают и помещают в нерестовый аквариум.
Нерестовый аквариум наполняют свежей отстоянной водой с жесткостью не более 4,0 мг экв/л, с температурой около 27°С и рН 6,8-6,9. В аквариум должна быть помещена сетка с ячеями 3 мм, которая служит для предохранения от поедания икры и личинок рыб взрослыми рыбами. Отложенная оплодотворенная икра опускается на дно, проходит сквозь сетку и становится недоступной для рыб. При размещении сетки следят, чтобы над сеткой осталось не менее одного литра воды для плавания производителей.
В нерестовый аквариум утром помещают самок и кормят сухим кормом, а вечером в этот же аквариум помещают по 2-3 самца на каждую самку, еще раз кормят всех рыб, а затем выключают свет. Стимулом к нересту служит утреннее включение света.
Обычно выклев у данио завершается через 48 ч после нереста, а еще через 48 ч предличинки начинают переходить на активное питание и становятся личинками. Переход предличинок на активное питание завершает данный этап исследований.
6.1.4. Проведение исследований
Для определения ПДК вещества на эмбрионах и личинках рыб ведут наблюдение за эмбриональным развитием данио и выклевом предличинок в контроле и исследуемых концентрациях веществ. После нереста взрослых рыб отсаживают, а оплодотворенные икринки помещают в чашки Петри. В каждую чашку с отстоянной водой (контроль) и с исследуемыми растворами помещают по 10 икринок. Концентрации исследуемого вещества готовят с шагом либо на порядок, либо в арифметической прогрессии, ориентируясь на максимальные допустимые концентрации вещества, полученные в опытах на других организмах. Исследование каждой концентрации проводится в трехкратной повторности.
Выклюнувшиеся предличинки помещаются по 10 штук в контрольную и тестируемую воду. Наблюдение ведется, как и в первом случае, в чашках Петри, которые должны находиться в термостатируемых условиях. Длительность эксперимента определяется переходом личинок на активное питание.
6.1.5. Учет и анализ результатов
Основными показателями токсичности вещества являются выживаемость эмбрионов и личинок, морфометрические параметры, тератологический анализ. В качестве дополнительных показателей эмбриотоксикологической оценки влияния исследуемых веществ могут служить биохимические исследования (например, липидный и белковый обмен у эмбрионов и предличинок рыб).
В опытах через каждые 6 ч учитывают состояние тест-объекта и ход выклева. Учитывается оплодотворение икры, а также гибель и морфологические изменения у эмбрионов в процентах по отношению к контролю.
Процент оплодотворения выявляется уже через сутки после нереста. Неоплодотворенные икринки белеют и легко отличаются от нормально развивающихся, которые остаются прозрачными.