5.1. Идентификация видоспецифичной растительной ДНК.
5.1.1. Идентификация ДНК сои, ген лектина:
- праймеры:
1) 5' GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 3',
2) 5' GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3';
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
Реактивы | Объем, мкл |
Деионизированная вода | 193,70 |
Буфер для ПЦР с MgCl (10х) | 25,00 |
Смесь нуклеотидов (4 млM) | 12,50 |
Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 секунд при 3000 об/мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об/мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
Стадия | Программа амплификации |
Денатурация | 3 мин/95°C, |
Амплификация | 30 сек/95°C, 30 сек/60°C, 40 сек/72°C, |
Количество циклов амплификации | 40 |
Конечное удлинение | 3 мин/72°C |
Фаза остывания | 4°C |
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 118 пар нуклеотидов, приложение 2.1.
5.1.2. Идентификация ДНК кукурузы, ген зеина:
- праймеры:
1) 5' TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG 3',
2) 5' GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT 3';
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
Реактивы | Объем, мкл |
Деионизированная вода | 193,70 |
Буфер для ПЦР с MgCl (10х) | 25,00 |
Смесь нуклеотидов (4 мM) | 12,50 |
Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 секунд при 3000 об/мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об/мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
Стадия | Программа амплификации |
Денатурация | 3 мин/95°C |
Амплификация | 1 мин/94°C, 1 мин/60°C, 1 мин/72°C |
Количество циклов амплификации | 40 |
Конечное удлинение | 7 мин/72°C |
Фаза остывания | 4°C |