МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРИКАЗ

от 26 марта 2001 года N 87


О совершенствовании серологической диагностики сифилиса

Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом остается крайне напряженной. С начала 90-х годов она возросла почти в 40 раз и в 1999 году достигла 186,7 случаев на 100 тыс. населения.

Серьезность ситуации усугубляется тем, что сифилис, как и другие инфекции, передаваемые половым путем, способствует распространению ВИЧ-инфекции.

Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом, является его ранняя диагностика.

Однако материально-техническая база серологических лабораторий не соответствует потребностям учреждений здравоохранения. За последние десять лет число кожно-венерологических диспансеров, не имеющих в своем составе серологических лабораторий, возросло с 25,3% в 1989 году до 31,2% в 1999 году.

С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, повышения качества работы и обеспечения единства подхода по ее организации

1. Утвердить:

1.1. Методические указания "Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис" (приложение N 1).

1.2. Методические указания "Расчетные нормы времени проведения лабораторных исследований при диагностике сифилиса методом реакции пассивной гемагглюцинации" (приложение N 2).

2. Директору Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава России А.А.Кубановой, директору Уральского научно-исследовательского института дерматовенерологии и иммунопатологии Минздрава России Н.В.Кунгурову, директору Нижегородского научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава России Н.К.Никулину:

2.1. Обеспечить организационно-методическое руководство по внедрению диагностических тестов в субъектах Российской Федерации в соответствии с приложениями N 1 и N 2.

2.2. До 01.06.2001 подготовить и представить в установленном порядке необходимые материалы на аккредитацию серологических лабораторий научно-исследовательских институтов в качестве экспертных в здравоохранении.

2.3. Обеспечить проведение внешнего контроля качества лабораторной диагностики сифилиса.

3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации:

3.1. Организовать работу по серологической диагностике сифилиса в соответствии с приложениями N 1, N 2.

3.2. Принять неотложные меры по развитию и укреплению материально-технической базы серологических лабораторий, обратив особое внимание на организацию таких лабораторий в составе кожно-венерологических диспансеров.

4. Считать не действующим на территории Российской Федерации приказ Министерства здравоохранения СССР от 2 сентября 1985 года N 1161 "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса".

5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на первого заместителя министра А.И.Вялкова.

Методические указания

ПОСТАНОВКА ОТБОРОЧНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ
ТЕСТОВ НА СИФИЛИС

Аннотация

Методические указания предназначены для лабораторных работников и клиницистов дерматовенерологической службы России. Указания посвящены современным методам серо- и ликвородиагностики сифилиса, широко апробированным в научно-исследовательских и лечебно-профилактических учреждениях страны. Представлены новые высоко чувствительные специфичные методики постановки реакций на сифилис. Освещено предназначение различных тестов в качестве отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности лечения. Описаны принципы реакций, методики их постановки, материально-техническое обеспечение, источники получения ошибочных результатов и мероприятия по технике безопасности при работе с инфекционным материалом.

Организация-разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.

Авторы: докт.биол.наук, проф.Г.А.Дмитриев, докт.мед.наук, проф.В.Н.Беднова, докт.мед.наук Г.Ф.Тимченко,  канд.мед.наук Г.А.Киселева, канд.мед.наук Т.И.Милонова, канд.мед.наук О.А.Стоянова, З.П.Акопова.

Введение

Для серо- и ликвордиагностики сифилиса в России могут применяться следующие методы:

1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР), которая является отборочным тестом при обследовании населения на сифилис. Постановка МР осуществляется с плазмой или инактивированной сывороткой крови. Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL), РПР (RPR) и другие аналогичны МР как по принципу постановки реакции, так и по чувствительности и специфичности.

2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.

3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.

4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца. Антиген - патогенная бледная трепонема штамма Никольса.

5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий из реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, и МР. Поскольку трепонемный антиген является специфическим, КСР относится к диагностическим тестам. В связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее трудоемких реакций стало возможным заменить при постановке КСР реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с МР.

6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.

РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и высокоспецифичными реакциями на сифилис. Они относятся к диагностическим подтверждающим тестам. При этом в связи с простотой постановки и наличием коммерческих тест-систем ИФА и РПГА могут быть и высокоэффективными отборочными тестами.

Ввиду различной чувствительности при разных формах сифилиса, специфичности и сложности постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.

Профилактическое обследование населения на сифилис можно проводить с помощью МР, КСР, ИФА и РПГА. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей.

При получении положительного результата в МР пациент должен обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови в любом диагностическом тесте на сифилис.

При профилактическом обследовании на сифилис больных глазных, психоневрологических, кардиологических стационаров, беременных, в частности, направляемых на искусственное прерывание беременности, должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.

При обследовании доноров необходимо применять КСР, или ИФА, или РПГА, но обязательно в сочетании с МР. Постановка двух реакций одновременно обусловлена высокой ответственностью данного исследования.

МР в количественном варианте с экономической точки зрения необходимо использовать в качестве контроля эффективности лечения, заменив ею количественную постановку РСК с кардиолипиновым антигеном.

Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики всех форм сифилиса, в частности, скрытого, а также для распознавания ложноположительных результатов, полученных в МР и КСР. При диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух специфических тестов одновременно.

Поскольку ИФА и РПГА являются более высокочувствительными, специфическими и воспроизводимыми тест-системами, которые можно использовать в качестве отборочных и подтверждающих тестов, осуществить до 2006 года замену комплекса серореакций (КСР) вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.

Таким образом, последовательность обследования пациентов на сифилис представляется следующим образом;

- при первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или ее модификации (RPR - РПР, TRUST - ТРАСТ, VDRL - ВДРЛ) в количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата - любого специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ).

- после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года.

- по окончании этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.

Методика постановки и суть различных модификаций МР, ИФА, РПГА, РИФ, РСК и РИТ подробно описаны в настоящих Методических указаниях.

Формула метода

Впервые детально описаны 6 методов, используемых для серо- и ликвородиагностики сифилиса, включающих 15 модификаций. Рекомендована замена РСК при определении эффективности лечения сифилиса МР, что дает экономический эффект. Введена в инструкцию количественная методика постановки РИТ, расширяющая возможности поздних форм сифилиса. Включены методики постановки РСК, РИТ, РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.

Показания к применению метода

Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.

Противопоказаний нет.

Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (экспресс-метод)

Принцип. При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.

Материально-техническое обеспечение метода

Оборудование для взятия крови и постановки МР:

- капиллярные пипетки аппарата Панченкова;

- градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;

- автоматические пипетки на 20-200 мкл;

- наконечники для автоматических пипеток;

- пробирки длиной 8-10 см и 14-15 см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;

- пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;

- иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;

- центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;

- аппарат для встряхивания;

- стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.

Ингредиенты для МР:

- антиген кардиолипиновый для микрореакции;

- холин-хлорид (включается в упаковку с антигеном);

- натрий хлорид х.ч.;

- натрий лимоннокислый (цитрат натрия) трехзамещенный NаС HO 5НО;

- мертиолат CHOS Na Hg.

Растворы:

- изотонический раствор натрия хлорида 0,9%;

- 10% раствор холин-хлорида. готовится следующим образом: к 29,65 мл изотонического раствора натрия хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мертиолата и 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Смесь тщательно перемешивают. При отсутствии мертиолата для приготовления 10% раствора холин-хлорида необходимо к 30 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствора холин-хлорида;

- 5% раствор трехзамещенного цитрата натрия готовится на дистиллированной воде и фильтруется. Раствор не стоек. При помутнении его надо заменять свежим. Хранится в холодильнике при 4° в течение 5-6 дней.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для установления пригодности эмульсии антигена. Отрицательную и положительную контрольные сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения ранее установленного титра, для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня.

Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунку по 90 мкл контрольной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в пипетку и 90 мкл переносят в третью лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают в аппарате в течение 5 минут, добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.