МУК 4.2.3695-21*
________________
     * МУК 4.2.3695-21 введены взамен методических рекомендаций "Методы микробиологического контроля почвы",
утвержденных заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.12.2004 N ФЦ/4022.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы микробиологического контроля почвы

Методические указания

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А.Ю.Попова 2 июня 2021 г.

Методические указания разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана" Роспотребнадзора (С.В.Кузьмин, Г.М.Трухина, П.В.Михеев, Н.А.Дмитриева,

Е.А.Вишневская, Е.П.Лаврик, О.Н.Исакова); ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Ю.Ананьев, М.В.Зароченцев, М.А.Ярославцева, В.В.Мордвинова).

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают методы и порядок проведения микробиологического контроля почвы (почва, песок, грунт, донные (придонные), иловые отложения, сапропели) жилых территорий, территорий образовательных, медицинских, оздоровительных организаций, курортных и рекреационных (скверы, парки, бульвары, пляжи, в том числе галечные, лесопарки) зон, игровых площадок и дворов, зон санитарной охраны водных объектов, территорий сельскохозяйственного назначения (поля, сады, огороды, приусадебные участки, тепличные хозяйства), промышленных зон, транспортных магистралей и других территорий, где возможно влияние загрязненных почв (песка) на здоровье и условия проживания населения, по показателям эпидемической безопасности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями.

________________

СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный номер 62296); СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный номер 62297).

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы органами и организациями (предприятиями), в том числе хозяйствующими субъектами и индивидуальными предпринимателями, осуществляющими исследования почвы по микробиологическим показателям.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Отбор, хранение и транспортировка проб

2.1. Отбор, хранение и транспортировка проб производятся в соответствии с методическими документами.

________________

Например, ГОСТ 17.4.3.01; ГОСТ 17.4.4.02.

III. Подготовка и обработка проб

3.1. Отобранные с соблюдением правил асептики пробы почвы с одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают примеси (прочие твердые предметы, неперегнившую растительную массу). Если проба однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке.

Затем пробу распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Данный квадрат почвы делят 2 диагоналями на 4 треугольника. Почву из 2 противоположных треугольников удаляют.

Оставшуюся часть почвы перемешивают, распределяют тонким слоем и повторяют процедуру деления и удаления до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг пробы.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемых определений. Почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке.

Для приготовления первого разведения почвенной суспензии (1:10) берут навеску в зависимости от выбранных методов исследований. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду (1 г пробы - в 9,0 см воды или 10 г пробы - в 90,0 см воды и т.д.).

Перед приготовлением дальнейших разведений применяется предварительная обработка почвы в зависимости от типа и вида учитываемого микроорганизма. Основная цель предварительной обработки почвы заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц.

3.2. Основными приемами предварительной обработки почвы является вертикальное перемешивание (механическое или ручное) почвенной суспензии первого разведения: 10 минут при навеске почвы 1 г; 3 минуты при навеске почвы более 1 г.

Почвенную суспензию, содержащую в 1 см 0,1 г почвы, используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г/см отбирают стерильной пипеткой 1,0 см почвенной суспензии и переносят в пробирку с 9,0 см стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 г/см (разведение 10) почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,001 г/см (разведение 10) и далее. Для приготовления каждого разведения используют стерильные пипетки или насадки к дозатору.

Допускается выбирать необходимое количество разведений в зависимости от предполагаемого загрязнения пробы, но не менее двух.

3.3. Ориентировочный список оборудования, расходных материалов, реактивов представлен в приложении 1 к настоящим МУК.

3.4. При выполнении микробиологического исследования следует отдавать предпочтение стандартизованным сухим питательным средам промышленного производства. При использовании промышленных сухих питательных сред следует соблюдать способ приготовления, применения и сроки хранения, указанные изготовителем.

Проверка ростовых качеств питательных сред, в том числе хромогенных, с применением тест-штаммов соответствующих микроорганизмов проводится в рамках внутрилабораторного контроля.

3.5. Для выявления и идентификации микроорганизмов возможно применение альтернативных методов исследований и автоматических микробиологических анализаторов в соответствии с методическими документами и инструкциями производителей.

3.6. Лабораториям рекомендовано иметь запас питательных сред для проведения исследований и производственного контроля.

3.7. Хранение и контроль питательных сред, дистиллированной воды, растворов, реактивов проводят в соответствии с методическими документами или инструкциями производителя.

________________

МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 06.07.2001, с изменениями, внесенными МУ 2.1.4.2899-11 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды. Изменение 1 к МУ 2.1.4.1057-01", утвержденными Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 12.07.2011; МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008; ГОСТ ISO 11133; ГОСТ ISO 7218.

IV. Определение ОКБ

4.1. Определение общих (обобщенных) колиформных бактерий, в том числе Escherichia coli, бактерий группы кишечных палочек (БГКП), лактозоположительных кишечных палочек (колиформы) (далее - ОКБ) титрационным методом

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой (дозатором) берут 10,0 см и засевают в 90,0 см лактозо-пептонной среды (далее - ЛПС) или среды Кесслера или в среду Эйкмана с лактозой, что соответствует посеву 1 г почвы.

По 1,0 см нативной почвенной суспензии и последующих ее разведений (0,1 г, 0,01 г, 0,001 г, то есть 10, 10, 10 разведения и т.д.), подготовленных по п.3.2, вносят в пробирки с 9,0 см питательной среды (ЛПС, среда Кесслера или среда Эйкмана с лактозой).

Посевы инкубируют до 48 ч при (37±1)°С с предварительным просмотром посевов через 16-18 ч инкубации.

При наличии в посевах признаков роста (помутнение, образование кислоты и газа или только помутнение) производят высев петлей на поверхность плотных питательных сред (например, Эндо, среды ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки) с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Чашки с посевами инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 16-18 ч. Посев из накопительных питательных сред можно производить на хромогенные питательные среды.

При обнаружении грамотрицательных и оксидазоотрицательных колоний идентификация проводится путем подтверждения ферментации лактозы. По 2-3 колонии каждого типа засевают параллельно в две пробирки с питательной средой, разлитой в количестве 4,0-5,0 см (например, полужидкая лактоза, среда Гисса с лактозой или аналогичные среды): одну пробирку инкубируют при температуре (37±1)°С, вторую - при температуре (44±1)°С. Учет производят через 16-18 ч инкубации.

Образование кислоты и газа при температуре (37±1)°С свидетельствует о наличии ОКБ. Наличие E. coli подтверждают образованием кислоты и газа при температуре (44±1)°С.

Для подтверждения наличия в пробе E. coli можно использовать лактозный бульон с борной кислотой (подтверждение роста и образование газа) или среду, содержащую триптофан (выявление способности бактерий продуцировать индол). Продукция индола определяется реактивом Ковача или индикаторной полоской.

Учет результатов проводят по приложению 2 к настоящим МУК.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 грамме почвы.

Результат по показателю ОКБ, в т.ч. E. coli отрицательный (не обнаружено), если:

- в среде накопления нет признаков роста через 48 ч инкубации;

- на плотной питательной среде нет роста или отмечается рост нехарактерных для колиформных бактерий колоний;

- все колонии оксидазоположительные;

- отсутствует образование кислоты и газа при идентификации.

В случае наличия кислоты и газа при (37±1)°С и отсутствии положительной реакции при (44±1)°С, результат исследования представляют числовым выражением количества ОКБ (КОЕ или клеток) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г). При наличии кислоты и газа при (37±1)°С и положительной реакции при (44±1)°С, результат исследования выражают суммарным числовым выражением количества ОКБ, в том числе E. coli (КОЕ или клеток) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

4.2. Определение ОКБ методом мембранной фильтрации

Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации. Метод основан на фильтрации почвенной суспензии через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде (например, Эндо, среда ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки) и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Мембранные фильтры готовятся к анализу в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для подготовки фильтровального аппарата воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут стерильным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум. При посеве нескольких разведений одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала объемы меньших разведений, а затем больших, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.