ГОСТ 32635-2020

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro

Methods of testing the impact of chemical products on the human body. Micronuclear test on mammalian cells in vitro

МКС 75.080

         11.020

11.120.01

Дата введения 2021-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Российский научно-технический центр информации по стандартизации, метрологии и оценке соответствия" (ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие проголосовали:

(Поправка. ИУС N 2-2021).

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 октября 2020 г. N 909-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32635-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2021 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD Test N 487:2016* "Руководство по испытанию химических веществ. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro" ("Guideline for testing of chemicals. In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test", MOD) путем:

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

- включения раздела 1, дополнительных сокращений (подраздел 2.2), которые выделены в тексте курсивом;

- изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВЗАМЕН ГОСТ 32635-2014

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 2, 2021 год      

Поправка внесена изготовителем базы данных

Введение

Руководства Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) по испытаниям химических веществ периодически пересматриваются в связи с научным прогрессом, меняющимися нормативными требованиями, а также в целях защиты животных. Первоначальная версия руководства OECD Test N 487 была принята в 2010 г. В 2016 г. она была пересмотрена в контексте общего пересмотра руководств OECD по генетической токсичности и отражает накопленный опыт проведения испытаний и интерпретации данных. Настоящее руководство является частью серии руководств по генетической токсикологии. В нем представлены краткая информация об испытании генетической токсичности и обзор последних изменений.

_______________

1) См. [1].

Микроядерный (MNvit) анализ in vitro - это метод оценки генотоксичности по выявлению микроядер (MN) в цитоплазме интерфазных клеток. Микроядра могут образовывать ацентрические фрагменты хромосом (т.е. с отсутствием центромеры) или целые хромосомы, которые не способны мигрировать к полюсам на стадии анафазы клеточного деления. Таким образом, MNvit анализ является методом in vitro, обеспечивающим всеобъемлющую основу для исследования потенциала повреждения хромосом in vitro путем определения кластогенного и анеугенного эффектов в клетках, которые подвергались делению во время или после воздействия исследуемого химического вещества (более подробная информация приведена в 4.2 настоящего стандарта). Микроядра представляют собой нарушения, которые было переданы дочерним клеткам в отличие от хромосомных аберраций, отмеченных в клетках в метафазе, которые могут не передаваться. В любом случае изменения могут быть несовместимыми с выживанием клеток.

_______________

См. [2], [3].

Настоящее руководство позволяет использовать протоколы как с применением ингибитора полимеризации актина цитохалазина В (cytoB), так и без него. Добавление cytoB перед митозом приводит к образованию двуядерных клеток и, таким образом, позволяет идентифицировать и проводить анализ микроядер только в тех клетках, которые завершили один митоз. Настоящее руководство также позволяет использовать протоколы без блокатора цитокинеза при наличии доказательств, что анализируемая клеточная популяция подверглась митозу.

_______________

См. [4], [5].

В дополнение к использованию анализа MNvit для определения веществ, индуцирующих микроядра, использование иммунохимического мечения кинетохор или гибридизации с центромерными/теломерными зондами [флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)] позволяет получить дополнительную информацию по механизмам хромосомных нарушений и образованию микроядер. Процедуры мечения и гибридизации могут быть использованы в случаях, когда происходит повышение частоты образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является это возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных факторов.

_______________

См. [6]-[17].

Поскольку микроядра в интерфазных клетках могут оцениваться относительно объективно, лабораторному персоналу нужно только определять количество двуядерных клеток при использовании cytoB и частоту возникновения микроядерных клеток во всех случаях. По этой причине микропрепараты могут быть оценены относительно быстро, а анализ может быть автоматизирован. Это позволяет на практике анализировать тысячи, а не сотни клеток при обработке, что повышает эффективность анализа. Наконец, поскольку микроядра могут образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность для выявления агентов, индуцирующих анеуплоидию, которую трудно изучать в обычном анализе на хромосомные аберрации. Однако анализ MNvit, приведенный в настоящем руководстве, не позволяет дифференцировать вещества, вызывающие изменения в количестве хромосом и/или плоидность, от веществ, индуцирующих кластогенность, без специальных методов, таких как FISH (см. предыдущий абзац).

_______________

См. [18].

Анализ MNvit является надежным и может проводиться на разных типах клеток, а также в присутствии или при отсутствии cytoB. Имеется большое количество данных, подтверждающих достоверность анализа MNvit с использованием разных типов клеток (культур клеточных линий или первичных клеточных культур). Они включают международное исследование по валидации анализа, координируемое французским обществом генетической токсикологии [ de Toxicologie (SFTG)], и доклады Международных совещаний по исследованию генотоксичности. Имеющиеся данные были также повторно оценены в ретроспективном валидационном исследовании весомости доказательств Европейским центром по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской комиссии (ЕС) и Научно-консультативным комитетом ECVAM (ESAC), и метод испытания был признан научно обоснованным. В анализе MNvit на клетках млекопитающих можно использовать культивированные клеточные линии или первичные клеточные культуры человека и грызунов. Поскольку на чувствительность анализа влияет фоновая частота микроядер, рекомендуется использовать типы клеток со стабильной и определенной фоновой частотой образования микроядер. Используемые клетки отбирают на основании способности хорошего роста в культуре, стабильности кариотипа (включая число хромосом) и спонтанной частоты микроядер. Данные, имеющиеся в настоящее время, не позволяют давать надежные рекомендации, но предполагают, что при оценке химической опасности важно учитывать статус р53, генетическую (кариотип) стабильность, способность к восстановлению ДНК и происхождение клетки (грызуна или человека), выбранной для анализа. Таким образом, пользователям данного руководства рекомендуется учитывать влияние этих и других характеристик клеток на характеристики клеточной линии при обнаружении индукции микроядер по мере развития знаний в этой области.

_______________

См. [19]-[36].

См. [19]-[23].

См. [5], [17].

См. [37]-[39].

См. [40].

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает требования к микроядерному анализу in vitro, применяемому для оценки генотоксичности химических веществ, путем выявления микроядер в цитоплазме интерфазных клеток, деление которых произошло во время или после воздействия исследуемого вещества.

     2 Термины, определения и сокращения

2.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1.1 анеуген (aneugen): Любое вещество или процесс, воздействие которых на компоненты митотического и мейотического циклов деления клеток приводит к анеуплоидии в клетках или организмах.

2.1.2 анеуплоидия (aneuploidy): Любое отклонение от нормального диплоидного (или гаплоидного) числа хромосом на одну или более хромосом, но не на полный набор хромосом (полиплоидия).

2.1.3 апоптоз (apoptosis): Процесс запрограммированной гибели клеток, характеризующийся серией этапов, приводящих к дезинтеграции клеток в мембранно-связанные частицы, которые затем элиминируются фагоцитозом или выделением.

2.1.4 клеточная пролиферация (cell proliferation): Увеличение числа клеток в результате митотического деления клеток.

2.1.5 центромера (centromere): Участок ДНК хромосомы, где две хроматиды соединяются вместе и оба кинетохора соединяются друг с другом.

2.1.6 концентрации (concentrations): Конечные концентрации исследуемого химического вещества в культуральной среде.