Установление характеристик и испытание клеточных субстратов из банков клеток представляет собой критическую составляющую контроля биологических и биотехнологических препаратов. Установление характеристик ГБК позволяет производителю оценить этот источник с точки зрения наличия клеток других клеточных линий, посторонних агентов, эндогенных агентов и молекулярных контаминантов (например, токсинов или антибиотиков из организма хозяина). Задача подобного тестирования состоит в подтверждении подлинности, чистоты и пригодности клеточного субстрата для использования в производстве. В некоторых случаях целесообразно проведение таких дополнительных испытаний, как проверка на туморогенность или кариотипирование. Программа проведения испытаний, выбранная для конкретного клеточного субстрата, может варьироваться в зависимости от биологических свойств клеток (например, потребности в питательных веществах для роста), истории культивирования клеточного субстрата (включая использование биологических реагентов человеческого или животного происхождения) и наличия подходящих аналитических методик. Объем исследований при установлении характеристик клеточного субстрата может влиять на вид или масштаб стандартных испытаний, необходимых на последующих стадиях производства. Для каждого ГБК производители должны однократно проводить испытания клеточного субстрата на подлинность и чистоту, а также испытание стабильности в ходе культивирования клеток для каждого подлежащего регистрации лекарственного препарата. Кроме того, испытания на чистоту и подлинность следует проводить однократно для каждого РБК. Заявители также должны принять во внимание положения главы 2 настоящих Правил. Необходимо провести соответствующие испытания из числа описанных ниже, их описание и полученные результаты необходимо представить в составе регистрационного досье.
При установлении характеристик клеточных линий, содержащих экзогенные экспрессирующие конструкции, созданные с использованием технологии рекомбинантной ДНК, следует руководствоваться также положениями главы 5.2 настоящих Правил. С помощью аналогичных методов целесообразно также провести анализ кодирующих последовательностей в некоторых клеточных линиях, при получении которых рекомбинантная ДНК не использовалась, если генные последовательности охарактеризованы и хорошо изучены. Однако не обязательно проводить исследования последовательностей, кодирующих такие сложные природные продукты, как, например, антигены микробных вакцин, моноклональные антитела из гибридом, семейства родственных генных препаратов.
При установлении характеристики клеточного субстрата и проведении испытаний производителям рекомендуется использовать современные методы и технологические достижения (при их доступности) при условии, что специфичность, чувствительность и прецизионность новых методов, по крайней мере, эквивалентна таковым параметрам существующих методов.
Производители могут проводить установление характеристик РБК вместо ГБК при условии представления соответствующего обоснования.
2.3.1. Испытания на подлинность.
Чтобы удостовериться в подлинности клеток в банке клеток, необходимо провести соответствующие испытания. При проверке подлинности могут быть оценены как фенотипические, так и генотипические характеристики, которые были установлены при разработке препарата. Не обязательно проводить все возможные испытания, однако объем выполненных испытаний должен быть обоснован. Испытания на подлинность обычно проводятся в отношении ГБК. Кроме того, ограниченный объем испытаний на подлинность, как правило, проводится в отношении каждого РБК.
2.3.1.1. Клетки Metazoa.
Морфологический анализ клеток человека или животных, выращиваемых в виде прикрепляющихся культур, может быть полезным инструментом в сочетании с другими тестами. В большинстве случаев для подтверждения происхождения клеточных линий человека или животных достаточно проведения изоферментного анализа, однако возможно проведение других тестов в зависимости от истории клеточной линии. Для верификации вида организма, из которого были получены клетки, могут быть использованы другие методики, включая, например, дифференциальное окрашивание хромосом (бэндинговая цитогенетика) или использование видоспецифичных антисывороток. Альтернативным подходом является демонстрация наличия уникальных маркеров, например, использование бэндинговой цитогенетики для обнаружения уникальной маркерной хромосомы или анализ ДНК для обнаружения геномного полиморфизма (например, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, вариабельность числа тандемных повторов или повторы геномных динуклеотидов). Достаточным испытанием на подлинность считается и установление вида животного, являющегося источником, и наличие изученных уникальных маркеров для клеточной линии. Экспрессия требуемого продукта может служить дополнением к подтверждению подлинности.
2.3.1.2. Клетки микроорганизмов.
Для большинства клеток микроорганизмов анализ роста на селективных средах обычно достаточен для подтверждения подлинности клетки-хозяина на уровне вида для банка клеток хозяина и банка трансформированных клеток. В случае E. coli, когда могут быть использованы разные штаммы, в качестве дополнительных методов испытания на подлинность следует рассматривать такой метод определения биологических характеристик, как фаготипирование. Для банков плазмид оценка подлинности может быть выполнена с помощью анализа экспрессирующей конструкции в соответствии с главой 5.2 настоящих Правил. Экспрессия требуемого продукта также может быть использована для подтверждения подлинности экспрессирующей конструкции.
2.3.2. Испытания на чистоту.
Важнейшим (критичным) аспектом разработки клеточной линии и создания банка клеток является оценка биологической чистоты ГБК и РБК, то есть доказательство того, что они свободны от посторонних микробных и клеточных контаминантов. При планировании и проведении этих испытаний необходимо учитывать влияние селективных агентов и антибиотиков на обнаружение посторонних микробных контаминантов.
2.3.2.1. Клетки Metazoa
Для проведения испытаний по оценке микробиологической чистоты (бионагрузки) (наличие бактерий и грибов) следует использовать индивидуальные контейнеры (1% от общего числа контейнеров, но не менее 2 контейнеров) для ГБК и РБК. В отношении остальных показателей следует использовать методологию испытаний микробиологических показателей или стерильности, предусмотренную Фармакопеей Евразийского экономического союза, утвержденной Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 11 августа 2020 г. N 100 (далее - Фармакопея Союза), или в иных фармакопеях в соответствии с Концепцией гармонизации фармакопей государств - членов Евразийского экономического союза, утвержденной Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22 сентября 2015 года N 119.
(Абзац в редакции, введенной в действие с 31 января 2023 года решением Совета ЕЭК от 15 июля 2022 года N 110; в редакции, введенной в действие с 4 февраля 2024 года решением Совета ЕЭК от 4 июля 2023 года N 77. - См. предыдущую редакцию)
ГБК и РБК должны быть испытаны на содержание микоплазм. Считаются достаточными методики Фармакопеи Союза, включающие в себя посев на агар и мясо-пептонный бульон, а также метод индикаторной клеточной культуры. Как правило, для проведения испытания достаточно клеток из одного контейнера. Для линий клеток немлекопитающих животных могут быть пригодны альтернативные методы контроля и (или) условия проведения испытаний. Для выбора соответствующей методики производители могут проконсультироваться с уполномоченными органами государств-членов.
Для обнаружения возможной контаминации вирусами должна быть разработана стратегия контроля клеточных субстратов на наличие вирусов, которая позволяет обнаруживать широкий спектр вирусов с использованием подходящих скрининг-тестов и соответствующих специфичных испытаний исходя из истории культивирования клеточной линии. Заявители должны применять требования главы 2 настоящих Правил. В отношении классов препаратов, не охваченных главой 2 настоящих Правил, следует руководствоваться рекомендациями ВОЗ по использованию животных клеток.
Чистота клеточных субстратов может быть нарушена в результате контаминации другими клеточными линиями, происходящими от того же или иного вида животных. Выбор необходимых испытаний зависит от существования возможности перекрестной контаминации другими клеточными линиями. В некоторых случаях необходимо поддержание роста разных клеточных линий в одной и той же лаборатории. При проведении процедур по созданию банка клеток, предусматривающих проведение открытых манипуляций, необходимо исключить одновременное проведение открытых манипуляций с другими клеточными линиями. Если в помещении, в котором осуществляется работа с банком клеток, находилась другая клеточная линия в момент, когда происходили открытые манипуляции с банком клеток (например, культивирование клеток, объединение, отбор аликвот выбранной клеточной линии), необходимо провести их испытания на наличие клеток (или продуктов, полученных из них) из второй клеточной линии. Как правило, указанные в подразделе 2.3.1 настоящей главы методы оценки подлинности клеток достаточны для выявления перекрестной контаминации другими клеточными линиями. Дополнительным подтверждением отсутствия перекрестной контаминации может быть получение препарата, соответствующего установленным требованиям.
2.3.2.2. Клетки микроорганизмов.
При планировании и проведении специфических испытаний на посторонние микробные и клеточные контаминанты в банках клеток микроорганизмов необходимо учитывать свойства клеток в банках, возможные контаминанты, упоминаемые в научной литературе, источники, методы и материалы, используемые при культивировании клеток, а также другие организмы, находящиеся в лаборатории, в которой создается банк клеток. Например, возможно проведение визуальной оценки характеристик изолированных колоний с использованием разных микробиологических сред, поддерживающих и не поддерживающих рост клеточного субстрата. Тем не менее от производителей не требуется обязательно охарактеризовывать устойчивые мутанты клеточного субстрата, возникающие при таких исследованиях, или другие артефакты таких испытаний. Цель таких испытаний состоит, скорее, в выявлении существующих контаминантов.
2.3.3. Стабильность клеточного субстрата.
Одним из направлений изучения характеристик клеток является установление их пригодности для целевого использования в производстве. Существуют две проблемы, связанные со стабильностью клеточного субстрата: постоянство производства целевого продукта и сохранение производительности при его хранении в определенных условиях.
В целях оценки стабильности в ходе культивирования для производства необходимо провести исследования не менее чем в двух временных точках: первая - на клетках, подвергшихся минимальному количеству субкультивирований, вторая - на клетках при предельном для производства клеточном возрасте in vitro, описанном в регистрационном досье, или при превышении его. Предельный для производства клеточный возраст in vitro следует определять на основании данных, полученных на клетках-продуцентах, выращиваемых в опытно-промышленном или промышленном масштабе до предлагаемого предельного клеточного возраста in vitro или до возраста, превышающего его. Как правило, клетки-продуценты получают из РБК. Клетки из ГБК можно использовать при соответствующем обосновании. Оценка стабильности клеточного субстрата проводится обычно один раз для каждого регистрируемого лекарственного препарата.
Первостепенное значение имеет оценка способности клеточного субстрата обеспечить постоянство производства требуемого продукта. Вид проводимых испытаний и объекты исследований зависят от типа клеточного субстрата, продукта и методов культивирования. Для клеточных линий, содержащих экспрессирующие конструкции на основе рекомбинантной ДНК, неизменность кодирующей области экспрессирующей конструкции должна быть подтверждена на предназначенных для производства клетках, культивируемых до предельного клеточного возраста in vitro или дольше. Такая проверка проводится путем испытания нуклеотидной последовательности, для этих целей также могут быть использованы испытания продукта в соответствии с главой 5.2 настоящих Правил. Для нерекомбинантных клеточных линий, в которых кодирующая последовательность требуемого продукта уже была проанализирована на уровне ГБК или РБК, стабильность кодирующей белок последовательности на протяжении процесса производства должна быть подтверждена в клетках-продуцентах, культивированных до предполагаемого предельного клеточного возраста in vitro или дольше, путем либо испытания нуклеотидной последовательности, либо анализа очищенного белкового продукта.
Если продукт не может быть исследован указанным способом, для оценки стабильности клеточного субстрата можно использовать другие специфичные методы, например, установление морфологических характеристик, параметров роста, биохимических и иммунологических маркеров, прочих генотипических или фенотипических маркеров или выход требуемого продукта. В некоторых случаях, когда прямое сравнение характеристик ГБК с характеристиками клеток-продуцентов на предельном клеточном возрасте in vitro или при его превышении осуществить трудно или невозможно, для оценки стабильности клеточного субстрата на протяжении процесса производства можно сравнивать характеристики клеток на начальной стадии культивирования или производства с характеристиками клеток на предельном клеточном возрасте in vitro или при его превышении. Для подобного рода испытаний можно использовать такие показатели, как, например, скорость потребления кислорода или глюкозы, скорость выделения аммиака или лактата. Увеличение установленного предельного для производства клеточного возраста in vitro должно быть подтверждено данными для клеток, культивирование которых продолжалось до нового предложенного предельного клеточного возраста in vitro. Для линий диплоидных клеток должны быть представлены данные, устанавливающие конечный предел продолжительности жизни клеток из РБК в условиях, идентичных используемым при производстве.
Стабильность клеток в банке клеток в установленных условиях хранения обычно подтверждают во время производства материала для клинических исследований. Данные об определении жизнеспособности законсервированных клеток должны подтвердить, что клетки пережили процесс консервации и могут быть использованы для получения требуемого продукта. Данные о производстве материалов для клинических исследований позволяют удостовериться, что из восстановленных клеток можно получить требуемый продукт. Доступные данные должны быть отражены в документах регистрационного досье. Кроме этого, должен быть представлен план мониторинга стабильности банков клеток. Предлагаемый мониторинг допускается проводить, когда один или более контейнеров банков клеток, подвергшихся консервации, оттаивают в производственных целях при надлежащем наблюдении за постоянством свойств продукта или производства или когда один или более подвергшихся криоконсервации ГБК оттаивают с целью приготовления новых РБК (при этом новые РБК должным образом квалифицированы). Если производство не проводилось в течение длительного времени, определение жизнеспособности банка клеток, используемого в качестве источника продуцирующего субстрата, должно проводиться через определенный интервал времени, указанный в регистрационном досье. Если жизнеспособность клеточного субстрата снижается незначительно, как правило, дальнейшие испытания ГБК или РБК считаются нецелесообразными.
2.3.4. Кариотипирование и исследование туморогенности.
Для оценки безопасности линии диплоидных клеток или для характеристики новой клеточной линии проводятся кариотипирование и исследование туморогенных свойств в зависимости от типа клеток, свойств продукта и производственного процесса. Применение расширенного анализа для определения относительного содержания анеуплоидных клеток считается нецелесообразным. Нет необходимости проводить кариотипирование клеточных линий грызунов или новых клеточных линий, не относящихся к диплоидным. Как указано в подразделах 2.3.1 и 2.3.2 настоящей главы, цитогенетический анализ является достаточным методом для оценки подлинности клеточного субстрата или его чистоты. Повторное испытание туморогенности на клетках с уже подтвержденным туморогенным потенциалом проводить не требуется.