Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза (не действует на территории РФ с 01.01.2021 на основании постановления Правительства Российской Федерации от 13.06.2020 N 857)

2.5. Определение бета-лактамазной активности гонококков

Принцип. При использовании чашечного метода по линии роста посева бета-лактамазопродуцирующего микроорганизма происходит искажение зоны задержки роста фонового стафилококка вокруг диска с пенициллином.

Реагенты: 1) питательная среда (см.2.1); 2) золотистый стафилококк (штамм 209) чувствительный к пенициллину (для газона); 3) стафилококк, продуцирующий бета-лактамазу (для газона); 4) чистая культура изучаемого микроорганизма.

Специальное оборудование (см.2.1).

Ход определения: 1) суточную культуру золотистого стафилококка (штамм 209) разводят в изотоническом растворе хлорида натрия по оптическому стандарту мутности до густоты 4,25 - 10 микробных тел. Для этого выросшую культуру на скошенной питательной среде заливают 3 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, смывают культуру стафилококка, 0,5 мл взвеси стафилококка переносят в пустую стерильную пробирку, густоту взвеси изотоническим раствором доводят до 5 ЕД по стандарту мутности, затем полученную взвесь в другой пробирке разводят еще в 10 раз; 2) стафилококк, продуцирующий бета-лактамазу, выращивается на питательной среде, и суточная культура его проверяется на чистоту; 3) суточная культура изучаемого микроорганизма также проверяется на чистоту; 4) 6 мл полученной, как указано выше, взвеси золотистого стафилококка (штамм 209) добавляют к 100 мл обогащенной питательной среды и разливают по 20 мл в чашки Петри. После застывания и подсушивания питательной среды в центр чашки помещают стандартный бумажный диск, пропитанный раствором пенициллина. Суточную чистую культуру изучаемых на бета-лактамазу микроорганизмов и контрольного штамма засевают радиальными штрихами, отступая на 1 мм от края диска. После инкубации в течение 24 часов в эксикаторе с 20% содержанием CO при 36-37° в питательной среде отмечается рост стафилококка за исключением зоны задержки роста вокруг диска, а по засеянным радиусам - сплошной рост испытуемых на бета-лактамазу микроорганизмов.

Оценка результатов. Чувствительные к пенициллину культуры вырастают лишь в той части штриха, которая удалена от диска, тогда как резистентные штаммы развиваются по всему засеянному радиусу, начиная от края диска. Если культуры выделяют бета-лактамазу, то она инактивирует пенициллин, в связи с чем зона задержки роста стафилококка, внесенного в питательную среду, в месте пересечения с ростом изучаемого микроорганизма по штриху искривляется, давая клиновидное втяжение агара с ростом фонового стафилококка по направлению к диску. Величина участков клиновидного втяжения зависит от степени продуцирования микроорганизмами бета-лактамазы. На каждой чашке с питательной средой удается исследовать одновременно до 8 различных культур.

Примечание: Хранить чашки с питательной средой, содержащей стафилококк, можно в течение 10 дней в холодильнике. Перед посевом на них испытуемых микроорганизмов чашки помещают в термостат при температуре 36-37° на 15-20 минут, затем кладут диск, пропитанный раствором пенициллина, засевают изучаемые культуры штрихами по радиусу и помещают на сутки в термостат при той же температуре в эксикаторе для выращивания.