Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза (не действует на территории РФ с 01.01.2021 на основании постановления Правительства Российской Федерации от 13.06.2020 N 857)

2.3 Идентификация гонококков в чистых культурах методом ферментации сахаров

Принцип. Гонококки способны расщеплять до кислоты находящуюся в питательной среде глюкозу и не расщеплять мальтозу, фруктозу, сахарозу и лактозу. Образовавшаяся в результате расщепления сахара кислота, благодаря наличию в среде индикатора, изменяет цвет среды.

Специальное оборудование (см.2.1). Необходим также столик, обеспечивающий горизонтальный уровень.

Реагенты. 1) мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (pH = 7,4-7,5); 2) желток свежего куриного яйца; 3) сахара: глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, лактоза; 4) индикатор феноловый красный водорастворимый; 5) 20% раствор едкого натрия; 6) стерильный изотонический раствор хлорида натрия; 7) стерильная дистиллированная вода; 8) этиловый спирт 96°; 9) чистая односуточная культура гонококка.

Приготовление питательной среды. Для приготовления среды необходима предшествующая подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1) Приготовление раствора индикатора фенолового красного: 0,2 г порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят pH до 7,8 раствором 20% едкого натрия, стерилизуют автоклавированием при 120° 20 минут.

2) Приготовление растворов сахаров: по 1,5 г сахара (глюкозы, мальтозы, лактозы, фруктозы, сахарозы) помещают в бактериологические пробирки, закрывающиеся ватно-марлевыми пробками, наливают в каждую пробирку по 2 мл стерильной дистиллированной воды, растворяют соответствующий сахар и стерилизуют кипячением в водяной бане в течение 15 минут.

3) Приготовление желточной эмульсии: скорлупу свежего куриного яйца дважды обрабатывают 96° этиловым спиртом, вскрывают скорлупу, отделяют стерильно желток от белка и помещают желток в стерильную колбу. Добавляют стерильный изотонический раствор из расчета 5 мл на 1 желток и тщательно эмульгируют с помощью пипетки.

В каждую из пяти колб емкостью 200 мл вносят 15 мл желточной эмульсии, 6 мл раствора индикатора фенолового красного и приготовленный раствор соответствующего сахара. Перемешивают и добавляют 100 мл мясопептонного агара из кроличьего мяса, предварительно расплавленного и охлажденного до 56°. Перемешивают и разливают в чашки Петри по 20 мл. Застывшую среду, после проверки ее на стерильность в термостате в течение 24 часов при 36-37°, можно использовать для опыта, а оставшуюся неиспользованной хранить до 4 недель в холодильнике при 4°.

Ход определения. Чистую культуру грамотрицательных кокков засевают на поверхность предварительно прогретой в термостате среды ферментации в виде двух взаимноперпендикулярных штрихов длиной 1 см (в каждой чашке возможен посев 5-6 штаммов гонококка). Затем чашки помещают в термостат в эксикаторе с влажной ватой на дне без создания в нем атмосферы повышенного содержания CO.

Оценку результатов производят через сутки. Изменение красного цвета среды в зоне роста исследуемой культуры на желтый оценивают как положительный результат. Если цвет среды остается красным или становится малиновым, то это регистрируется как отрицательный результат.

Второй вариант. С целью экономии питательной среды, в тех случаях, когда необходимо определить ферментативные свойства 1-2 штаммов микроорганизмов, применяют одночашечный модифицированный способ определения сахаролитических свойств грамотрицательных микроорганизмов.

Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:

1) приготовление 0,2% раствора индикатора;

2) приготовление растворов сахаров в растворе индикатора: 7,5 г каждого из пяти сахаров помещают в стерильные колбочки или бактериологические пробирки, наливают в каждую по 10 мл 0,2% стерильного раствора фенолового красного, приготовленного как указано ранее, и стерилизуют кипячением в водяной бане 15 минут.

Неиспользованные растворы можно хранить в холодильнике при 4° в течение одного месяца;

3) Приготовление желточной эмульсии производится как указано ранее (см.2.3);

4) Приготовление среды ферментации: к 100 мл мясопептонного агара из кроличьего мяса, предварительно расплавленного и охлажденного до 56°, добавляют 15 мл желточной эмульсии, разливают по 20 мл в чашки Петри, которые тотчас же должны быть установлены на строго горизонтальной поверхности. Застывшую среду, после проверки ее на стерильность в термостате в течение 24 часов, можно использовать в опыте, а неиспользованную хранить в холодильнике при 4° в течение одного месяца.

Ход определения: перед посевом исследуемой чистой культуры грамотрицательных кокков чашку со средой прогревают в термостате, после чего дно чашки делят с внешней стороны на пять секторов и устанавливают на горизонтальной плоскости. На поверхность среды каждого сектора стерильной пастеровской пипеткой наносят по 1 капле раствора каждого из 5 вышеуказанных сахаров, приготовленных в растворе индикатора, как указано выше. После того как произойдет полное всасывание нанесенных растворов в среду, производят посев в виде 2 взаимноперпендикулярных штрихов длиной 1 см исследуемой культуры в зоне нанесения растворов углеводов в растворе индикатора. Эта модификация обеспечивает определение сахаролитических свойств одного штамма при использовании одной чашки со средой вместо пяти. Инкубация посевов и учет результатов осуществляется как указано выше.