Принцип. Метод основан на свойстве гонококков, влагалищных трихомонад и других грамотрицательных микроорганизмов при обесцвечивании их определенное время в этиловом спирте отдавать основной фиолетовый краситель и докрашиваться в дальнейшем дополнительным оранжево-красным.
Реактивы. 1) 1% водный раствор кристаллвиолета: 1 г кристаллвиолета растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, раствор фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. 2) Водный люголевский раствор: 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г чистого йода, фильтруют через бумажный фильтр. 3) 96° этиловый спирт. 4) 1% водный раствор нейтрального красного: 1 г нейтрального красного растворяют в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр.
Специальное оборудование, приготовление препаратов (см.1.1).
Ход окраски. Препарат покрывают полоской фильтровальной бумаги и заливают ее 1% водным раствором кристаллвиолета на 1 минуту. Следят, чтобы между фильтровальной бумагой и стеклом не было пузырьков воздуха, их удаляют, придавливая полоску смоченной кристаллвиолетом фильтровальной бумаги стеклянной пипеткой или палочкой. Через 1 минуту бумагу снимают, препарат промывают водопроводной водой и заливают раствором Люголя, который выдерживают в течение нескольких секунд до почернения мазка. Затем остаток люголевского раствора смывают и приступают к обесцвечиванию препарата в 96° этиловом спирте. Обесцвечивание проводят под контролем глаза, поочередно погружая и вынимая препарат из спирта, находящегося в стаканчике. Обесцвечивают препарат до тех пор, пока с его тонких участков перестанут стекать фиолетовые струйки красителя и они станут бледно-серого цвета. Препарат быстро промывают под струей водопроводной воды, а затем докрашивают в течение 3 минут 1% водным раствором нейтрального красного. Препарат тщательно промывают, пока струя воды, стекающая с него, станет прозрачной, и высушивают.
Микроскопия. При правильной окраске препарат оранжево-красного цвета на тонких участках, лилово-фиолетового на толстых. Ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) должны частично удерживать основную фиолетовую окраску, т.е. в центре они должны быть окрашены в фиолетовый цвет, по периферии в оранжево-красный, а гонококки, расположенные в лейкоцитах и на эпителиальных клетках, будут оранжево-красные. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания препарата: при недообесцвечивании - когда в фиолетовый цвет интенсивно окрашены ядра клеток, гонококки могут сохранять фиолетовую окраску, в переобесцвеченных препаратах стафилококки и стрептококки могут быть окрашены в оранжево-красный цвет и приняты за гонококки.
Идентификация гонококка производится на основании его свойств: морфологии, расположения и отношения к окраске по способу Грама. Гонококк - это парный кокк, имеющий форму кофейного зерна; кокки обращены друг к другу своей вогнутой стороной. Размножаясь делением в разных плоскостях, гонококки не образуют цепочки. Внутри лейкоцитов они располагаются парами или группами так, что одни диплококки лежат по отношению к другим под различными углами. Внеклеточное расположение гонококков также имеет свои характерные особенности. Часто гонококки лежат на клетках плоского эпителия в большом количестве рядами с расположением диплококков перпендикулярно друг к другу внутри ряда. Частота внутри- и внеклеточного расположения гонококков зависит как от периода заболевания, так и от методики взятия материала. При идентификации гонококка необходимо учитывать все три его основных признака. Положительный ответ нужно давать при обнаружении только типичных форм гонококков. Влагалищные трихомонады окрашиваются бледно: оболочка в виде тонкой полоски окружает сетчатую протоплазму оранжево-красного цвета, ядро сиреневого или фиолетового цвета, жгутики и ундулирующая мембрана не просматриваются.