Принцип. Обнаружение возбудителя производят в культуре, масса которой увеличивается при росте на искусственных питательных средах.
Питательная среда. Необходимо использовать питательную среду для выделения гонококка, сухую, выпускаемую Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов Минздрава СССР*.
________________
* При отсутствии указанной питательной среды для выделения гонококка, сухой разрешается в лаборатории готовить одну из нижеперечисленных питательных сред.
1. Среда КДС-1: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (pH = 7,4-7,5) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального белкового питания - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл.
2. Среда ГДС-2: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (pH = 7,4-7,5) - 100 мл, 5% раствор гемогидролизата - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл.
3. Среда СДС-199: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (pH = 7,4-7,5) - 100 мл, среда 199 для культур тканей без антибиотиков - 20 мл или 2 мл ее 10-кратного концентрата, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (в указанных средах дрожжевой аутолизат можно заменить 1,5% раствором экстракта кормовых дрожжей).
4. Среда ЖС: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (pH = 7,4-7,5) - 100 мл, желток свежего куриного яйца - 10 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл.
5. Асцит-агар: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (pH = 7,4-7,5) - 100 мл, асцитическая жидкость - 25-40 мл.
6. Среды с антибиотиками: к указанным (N 1-5) средам добавляют 20,0 ЕД/мл полимиксина М сульфата и 2 мкг/мл линкомицина гидрохлорида. Для диагностики фарингеальной гонореи к среде с антибиотиками добавляют 1 мкг/мл оротовой кислоты. В связи с малой концентрацией оротовой кислоты ее навеску, равную 1 мг (1000 мкг), разводят в 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (получается рабочий раствор, содержащий 1000 мкг, который может сохраняться в холодильнике в течение 10 дней) и стерилизуют в водяной бане 15 минут, затем отбирают необходимое количество рабочего раствора и добавляют к уже обогащенной другими ингредиентами питательной среде.
Способ приготовления рабочей среды: перед применением во флакон N 1 с основой питательной среды добавляют 100 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживают для набухания агара 1 час, затем флакон переносят в водяную баню и выдерживают при 100°C до растворения среды (обычно около 30 минут), возможен небольшой осадок или опалесценция среды. Во флакон N 2 с обогащающими добавками добавляют 20 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживают 20 минут при комнатной температуре до растворения содержимого флакона, которое затем добавляют к охлажденной до 50° основе питательной среды во флакон N 1 и тщательно перемешивают. Полученную таким образом обогащенную среду разливают по 3-3,5 мл в стерильные пробирки и скашивают, в пробирки со скошенной средой добавляют по 0,5 мл стерильного мясопептонного бульона или изотонического раствора хлористого натрия для увлажнения среды. Проверяют на стерильность при 37° в течение 24 часов.
Оборудование: водяная баня, автоклав, термостат, холодильник, эксикатор, pH-метр, чашки Петри, пробирки, колбы, пипетки, воронки, градуированные и пастеровские бутыли, газовая горелка или спиртовка, скальпели, мясорубка, кастрюли, бактериологические петли.
Реактивы, ход окраски мазков, микроскопия (см.1.4).
Приготовление препаратов. Выросшую в пробирке культуру снимают бактериологической петлей, наносят в каплю водопроводной воды на предметном стекле, эмульгируют и высушивают при комнатной температуре.
Примечание. Выращивание гонококков можно производить в пробирках или чашках Петри, первый способ обеспечивает значительную экономию среды. Для повышения процента высеваемости гонококков засеянные питательные среды помещают в термостат (36-37°) в эксикаторе с 20% содержанием углекислого газа. Колонии гонококков чаще вырастают в течение 1-2 суток, но возможен рост и в последующие 7-8 суток, поэтому обязательным является ежедневное исследование культур. Выросшую культуру исследуют микроскопически: изучают вид колоний, проводят исследование на цитохромную оксидазу, готовят из колоний гонококка и другой флоры мазок для микроскопического исследования. Колонии гонококка прозрачные или слегка мутные, бесцветные или белесоватые, имеют круглые очертания, ровные края, блестящую поверхность. При снятии колоний с поверхности среды петлей и получении суспензии гонококков в изотоническом растворе или водопроводной воде на предметном стекле определяется их слизистая консистенция.
Идентификацию гонококков в культурах проводят при исследовании выросших культур в мазках, окрашенных по модифицированному способу Грама.
При бактериологической диагностике гонореи большое значение имеет правильная окраска мазков из культур и квалифицированное их исследование. Критерием правильной окраски мазков является наличие недообесцвеченных участков в толстых местах мазка. При этом при правильной окраске в центре скоплений из оранжево-красных микроорганизмов наблюдаются группы кокков или отдельные участки мазков, окрашенные в фиолетовый цвет.
При исследовании мазков из культур необходимо учитывать морфологию, расположение и окраску гонококков. Они представляют собой, главным образом, не парные, а отдельные кокки, собранные в скопления с более плотным центром и как бы рассыпанные беспорядочно по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в оранжево-красный цвет кокками встречаются бледно окрашенные формы, а также особи неправильно округлых очертаний. Полиморфность гонококков увеличивается по мере старения культуры. Гонококки не образуют в культуре цепочек и гроздей, что свойственно стрептококкам и стафилококкам. Следует отметить, что нередко встречаются штаммы стрептококков, легко теряющие свою первоначальную фиолетовую окраску при обесцвечивании спиртом и в процессе окраски приобретающие грамотрицательность. Без учета морфологии и расположения кокков в данном случае легко может быть допущена лабораторная ошибка - стрептококки могут быть приняты за гонококки.