Первый день.
Идентификация энтеробактерий начинается с изучения их колоний на пластинчатых средах. Для целей клинической микробиологии это, в первую очередь, среды Эндо или ЭМС-агар (с эозин-метиленовым синим), обладающие дифференциально-диагностическими свойствами. При исследовании кишечного содержимого могут быть использованы дополнительно среды Плоскирева, висмут-сульфитный агар, слабощелочной и кровяной агар.
На среде Эндо колонии представителей семейства Enterobacteriaceae обычно выпуклые с правильными очертаниями (круга), более или менее опалесцирующие, иногда слизистые. Они могут быть окрашены в красный цвет с наличием металлического блеска или без него (лактозоположительные энтеробактерии), бесцветными (лактозоотрицательные), могут приобретать розоватый или сероватый оттенок с более или менее выраженным темным центром, особенно у более крупных колоний.
Диаметр и окраска колоний могут варьировать не только в зависимости от родовой принадлежности, но и от массивности роста. В среднем диаметр колоний составляет 1-2 мм, мелкие бесцветные колонии-росинки - характерны в 1 сутки роста для иерсиний (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis)*.
________________
* Такие чашки необходимо дополнительно инкубировать при комнатной температуре еще 18-20 часов.
P. vulgaris и P. mirabilis обычно дают вуалеобразный рост ("роение"), а представители родов Klebsiella и Enterobacter чаще образуют сочные слизистые розовые колонии диаметром 2-3 мм. Шигеллы, сальмонеллы, гафнии, нероящиеся представители рода протеев обычно образуют более "нежные" колонии небольших размеров. Часть штаммов серраций дает розово-красные, с фуксиновым оттенком пигментированные колонии.
Намеченные для дальнейшего изучения колонии снимают бактериологической петлей (или иглой) и засевают штрихом по косяку и уколом в столбик комбинированной среды для первичной идентификации. Наиболее принятыми в отечественных лабораториях являются среды Клиглера, Олькеницкого и их модификации. Эти двух- (лактоза, глюкоза) и трех- (лактоза, глюкоза, сахароза) сахарные среды, включающие для выявления образования сероводорода: аммоний-железо (II)-сульфат (соль Мора), натрий тиосульфат (гипосульфит) и мочевину, позволяют после 18-20-часовой инкубации их при 37°C составить предварительное заключение о возможной родовой принадлежности выделенных культур и определить набор необходимых тестов для идентификации рода и вида.
Для иерсиний дополнительная и параллельная инкубация посевов при комнатной температуре обеспечивает более четкое проявление биохимических реакций.
Второй день.
Учет результатов посева в среду для первичной идентификации.
Микроскопия окрашенных по Граму мазков.
Микробы семейства Enterobacteriaceae дают на поверхности скошенной части среды Клиглера, Олькеницкого (или модификации) влажный, однородный, опалесцирующий рост без пигментообразования (за исключением представителей рода Serratia).
Ферментация глюкозы - облигатное свойство всех энтеробактерий - проявляется в изменении окраски столбика среды (цвет зависит от используемого в среде индикатора, а также интенсивности кислотообразования).
При наличии в составе среды мочевины (среда Олькеницкого и ее модификации) окраска столбика среды не меняется в случаях выделения энтеробактерий, гидролизующих мочевину (многие представители родов Citrobacter, Klebsiella, Proteus, вида E. cloacae, кроме P. inconstans, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, иногда S. marcescens). В этих случаях кислые продукты ферментации глюкозы нейтрализуются щелочными продуктами гидролиза мочевины.
Особенности гидролиза мочевины клебсиеллами и иерсиниями не всегда позволяют выявить этот признак при включении мочевины в комбинированную среду. Более надежным для них является определение уреазной активности в средах с мочевиной по Кристенсену или по Преусу, для чего параллельно с посевом в комбинированную среду делают посев в пробирку со средой Кристенсена.
Неизменная окраска столбика среды, не содержащей мочевины (среда Клиглера), свидетельствует о выделении микробов, не относящихся к семейству Enterobacteriaceae*.
________________
* Для подтверждения такого заключения используют тест на цитохромоксидазу (отрицательный у энтеробактерий), а при необходимости и другие в соответствии с "Определителем Берги", 1980.
Кроме кислотообразования, по наличию разрывов (отслаиванию среды от стенок или дна пробирки) в столбике комбинированной среды судят об образовании при ферментации глюкозы газообразных продуктов (газообразование характерно для большинства эшерихий, эдвардсиелл, цитробактеров, подавляющего большинства сальмонелл, представителей трибы клебсиелл, отдельных видов протея).
Почернение среды, появляющееся в средней или нижней части столбика, происходит при образовании выделенным микробом сероводорода, что свойственно, представителям рода Salmonella, видов C. freundii, P. vulgaris, P. mirabilis, Edwardsiella и некоторым представителям рода Erwinia.
Способность ферментировать лактозу (а в трехсахарной среде и сахарозу) оценивают по изменению окраски скошенной части комбинированной среды. Обычно лактозоположительными бывают представители родов Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter. Ферментация лактозы нередко коррелирует с ферментацией сахарозы. В неясных случаях следует проверить эти свойства путем посева культур в среды Гисса с соответствующими углеводами.
Таким образом, через 18-20 часов инкубации посева в комбинированную среду и одновременно в среду с мочевиной по Кристенсену или по Преусу возможен учет 4-5 признаков, характеризующих выделенную культуру, что позволяет значительно сузить диапазон подозреваемых родовых групп.
Сходное сочетание биохимических реакций (отношение к лактозе, глюкозе, мочевине, образование сероводорода) может наблюдаться одновременно у нескольких родовых групп семейства Enterobacteriaceae, и для их дифференциации необходимо использовать дополнительные тесты, минимально необходимые для установления родовой, а, в ряде случаев, и видовой принадлежности. Известно немало рекомендаций по составу таких минимальных наборов дифференциальных тестов для определения рода в семействе Enterobacteriaceae. В таблице 13 (нижняя часть) представлены тесты, наиболее остро необходимые и относительно более доступные практическим бактериологическим лабораториям.