МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР
ПРИКАЗ
от 22 апреля 1985 года N 535
Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений
____________________________________________________________________
Не действует на территории Российской Федерации на основании
приказа Минздрава России от 24 августа 2020 года N 889
____________________________________________________________________
Микробиологические (бактериологические) исследования занимают важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях.
Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.
Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие изменилась: значительно увеличился удельный вес заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами (около 200 видов условно-патогенных микроорганизмов). Возрастает роль неспорообразующих анаэробов и некоторых других видов микроорганизмов, роль которых в инфекционной патологии ранее была неизвестна.
Принадлежность возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний к условно-патогенным и сапрофитическим организмам существенно изменяет проведение и оценку микробиологических (бактериологических) исследований и требует новых методических подходов.
Для развития микробиологических (бактериологических) исследований в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений необходимо дальнейшее совершенствование материально-технической базы лабораторий, расширение номенклатуры стандартных селективных питательных сред, стандартных наборов для экспресс-методов идентификации условно-патогенных микроорганизмов, агглютинирующих сывороток и увеличение выпуска некоторых видов оборудования.
Требует совершенствования система заявок на бактерийные препараты для клинико-диагностических лабораторий.
В целях совершенствования микробиологических (бактериологических) лабораторных исследований в лечебно-профилактических учреждениях, повышения уровня и эффективности микробиологической диагностики:
I. Утверждаю:
1. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях (Приложение 1).
2. Задание на разработку сухих питательных сред, тест-наборов, агглютинирующих сывороток для диагностики заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (Приложение 2).
II. Приказываю:
1. Министрам здравоохранения союзных и автономных республик, заведующим краевыми, областными отделами здравоохранения, начальникам главных управлений здравоохранения Московского, Ленинградского, Киевского и Ташкентского горисполкомов и Московского облисполкома:
- обеспечить освоение сотрудниками клинико-диагностических лабораторий унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования и организовать, начиная с 1985 года, проведение микробиологических (бактериологических) исследований во всех клинико-диагностических лабораториях по унифицированным методам, утвержденным настоящим Приказом (согласно Приложению 1).
2. Главному управлению по производству бактерийных и вирусных препаратов (тов.Хлябич Г.Н.) для обеспечения проведения микробиологических (бактериологических) исследований в соответствии с унифицированными методами, принять меры по увеличению номенклатуры современных унифицированных питательных селективных сухих стандартных сред для условно-патогенных микроорганизмов; тест-систем для идентификации микроорганизмов; агглютинирующих сывороток (в соответствии с Приложением 2).
3. Главному аптечному управлению Министерства здравоохранения СССР (тов.Клюев М.А.), в целях наиболее полного удовлетворения потребности клинико-диагностических лабораторий бактерийными препаратами, организовать их обеспечение в соответствии с номенклатурой, предусмотренной заявкой на бактерийные и вирусные препараты, через Министерства здравоохранения союзных республик.
4. Главному управлению учебных заведений Министерства здравоохранения СССР (тов.Лакин К.М.) в течение 1986 года разработать методические рекомендации по применению унифицированных методов исследования для преподавателей кафедр микробиологии институтов усовершенствования врачей.
Контроль за выполнением настоящего Приказа возложить на Главное управление лечебно-профилактической помощи (тов.Москвичев А.М.).
Разрешается размножить Приказ в необходимом количестве.
Заместитель Министра
Ю.Ф.Исаков
Приложение 1
к Приказу Министерства
здравоохранения СССР
от 22 апреля 1985 года N 535
Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях
Перечень унифицированных микробиологических методов исследования
1. Микробиологические методы исследования биологического материала.
1.1. Микробиологические методы исследования крови.
1.2. Микробиологические методы исследования спинномозговой жидкости.
1.3. Микробиологические методы исследования желчи.
1.4. Микробиологические методы исследования мочи.
1.5. Микробиологические методы исследования отделяемого дыхательных путей.
1.6. Микробиологические методы исследования открытых инфицированных ран.
1.7. Микробиологические методы исследования отделяемого глаз.
1.8. Микробиологические методы исследования отделяемого ушей.
1.9. Микробиологические методы исследования отделяемого женских половых органов.
1.10. Микробиологические методы исследования материалов при аутопсии.
2. Микробиологические методы идентификации микроорганизмов различных родов и семейств*.
________________
* Идентификация проводится с применением бактерийных препаратов в соответствии с номенклатурой заявки-заказа на бактерийные и вирусные препараты Главного аптечного управления Министерства здравоохранения СССР.
2.1. Микробиологические методы идентификации микробов рода стафилококка (Staphylococcus).
2.2. Микробиологические методы идентификации микробов семейства стрептококковых (Streptococcaceae).
2.3. Микробиологические методы идентификации микробов семейства нейссериевых (Neissariaceae).
2.4. Микробиологические методы идентификации микробов рода гемофилус (Haemophilus).
2.5. Микробиологические методы идентификации микробов рода коринебактерия (Corynebacterium).
2.6. Микробиологические методы идентификации микробов семейства энтеробактериевых (Enterobacteriaceae).
2.7. Микробиологические методы идентификации микробов рода псевдомонас (Pseudomonas).
3. Общие методы исследования.
3.1. Микроскопические методы (окраска препаратов).
3.2. Культуральные методы (питательные среды).
3.3. Биохимические методы.
1. Микробиологические методы исследования биологического материала
1.1. Микробиологические методы исследования крови
Сепсис, бактериемию могут вызывать практически все микроорганизмы, относящиеся к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Из последних наибольшее значение имеют: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Aerococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa; представители родов: Klebsiella, Yersinia, Candida и другие.
Взятие исследуемого материала
1. Кровь для посева следует брать, соблюдая правила асептики, для того, чтобы избежать попадания микроорганизмов из внешней среды.
2. Посев необходимо проводить во время подъема температуры, в начале появления лихорадки.
3. Кровь для посева следует брать до начала специфического антибактериального химиотерапевтического лечения, или, по крайней мере, через 12-24 часа после последнего введения препарата больному (в зависимости от скорости выведения примененного препарата из организма). Следует учитывать также стадию заболевания с тем, чтобы взять кровь для посева в то время, когда предполагается бактериемия (например, при брюшном тифе в первые 10-15 дней от начала заболевания).
4. Для результативного бактериологического исследования необходимо сеять достаточные количества крови (не менее 10 мл у взрослых и 5 мл у детей) в большое количество жидких питательных сред. Это делается для того, чтобы путем разведения крови (1:10-1:60) преодолеть естественные бактерицидные свойства крови. Для нейтрализации антибактериальных факторов крови, включая комплемент, рекомендуется, по возможности, применять полианитол-сульфонат натрия 0,025-0,03%.
5. Для взятия крови необходимо пользоваться стерильным шприцем. Системы для одноразового пользования или шприцы, простерилизованные в централизованной стерилизационной, освобождают от упаковки только непосредственно перед употреблением. При отсутствии централизованной стерилизационной надо прокипятить 20-граммовый (для детей 10-граммовый) шприц и соответствующие иглы с мандреном для венопункции в течение 30-45 минут в отдельном стерилизаторе. По окончании стерилизации слить воду и остудить шприц, не открывая стерилизатора. Собрать шприц с помощью стерильного пинцета, насадить иглу и вытащить мандрен. Нельзя пользоваться шприцем со "стерильного стола" в перевязочной, т.к. на нем могут оказаться бактерии из воздуха. По той же причине нельзя проверять проходимость простерилизованного шприца и иглы воздухом.
6. Кровь на посев берут у постели больного или в перевязочной стерильным шприцем или системой для взятия крови одноразового пользования с соблюдением всех правил асептики и засевают тут же у постели больного. Взятие крови и ее посев осуществляют, как правило, два человека. Пока один человек обрабатывает кожу больного над пунктируемой веной, пунктирует вену и берет кровь, другой - над пламенем спиртовки открывает пробки флаконов, подставляет флаконы со средой под струю крови из шприца или системы, обжигает горлышки и пробки флаконов и закрывает их.
Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70% спиртом, затем 5% настойкой йода, затем снова спиртом. При наличии у больного постоянного подключичного катетера или капельницы в вене можно воспользоваться ими для получения крови. Некоторому количеству крови дают свободно стечь в пробирку (эту кровь можно использовать для биохимических анализов), затем набирают кровь в шприц для посева. Для полноценного бактериологического анализа нужно получить 12-20 мл крови, которую тут же засевают на набор питательных сред. Для получения "толстой капли" одну каплю крови из шприца или системы помещают на предметное стекло и подсушивают ее на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (спирт - эфир ) и затем окрашивают спиртово-водным раствором метиленового синего (96% этилового спирта - 10 мл, метиленового синего - 1 г, дистиллированной воды - 100 мл) или по Романовскому-Гимза. Врач-бактериолог должен следить за соблюдением правил асептики на всех этапах взятия и посева крови. Если возникает подозрение, что в какой-то момент в посев крови могли попасть микроорганизмы из внешней среды (с кожи больного, с рук персонала, из воздуха и т.п.) и нет возможности повторить посев, следует сделать специальную пометку на соответствующем флаконе, чтобы соответственно оценить результаты посева.
Посев исследуемого материала
Рекомендуется производить посев крови на несколько питательных сред, чтобы обеспечить возможность роста максимально большему числу возможных возбудителей. Минимально следует использовать две среды: "двойную среду" и "среду для контроля стерильности".
Питательные среды для первичного посева:
1. "Двойная среда", состоящая из скошенного во флаконе 150 мл 1,7%-2% питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь засевают в жидкую часть среды. Инкубируют в термостате при 37°C. Флаконы ежедневно просматривают, при этом, наклоняя флакон, смачивают поверхность скошенного агара бульоном. Это исключает необходимость высева на плотные питательные среды и, следовательно, уменьшает риск загрязнения при пересевах.
2. "Среда для контроля стерильности". Эту среду следует обогатить, добавив дрожжевой экстракт до 20 г на 1 литр (не менее 15 г) и агар до 5 г на 1 литр (не менее 4,25 г). Добавляют к среде 0,001 г резазурина - индикатора кислорода. Анаэробные условия контролируют по розовому окрашиванию среды. При покраснении более 20% столбика среды можно ее регенерировать на водяной бане в течение 20 минут при 100°C. Однако, эту операцию можно производить только один раз. Среда дает возможность получить рост некоторых анаэробных и полуанаэробных микроорганизмов.
3. "Среда со стаканчиком" (А.И.Сироко, 1969 год), - для предварительного лизиса форменных элементов крови. Для приготовления этой среды во флаконы с широким горлом (диаметром 30 мм), емкостью 250 мл наливают 50 мл дистиллированной воды, содержащей 0,1% агара. В этот флакон пинцетом опускают стеклянный стаканчик или пробирку длиной 70 мм и диаметром 20-22 мм, в которой находится 12 мл концентрированной питательной среды: (состав: на 100 мл перевара Хоттингера с остаточным азотом 750-800 мг%, 2 г глюкозы, 2 г хлористого натрия, pH 7,5-7,4). Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм.
Для получения гемокультуры в "среде со стаканчиком" в агаризованную воду помещают 3-5 мл крови. Оставляют флакон при комнатной температуре на 30-40 минут для гемолиза форменных элементов крови. Затем, наклоняя флакон, выливают содержимое стаканчика в водный раствор с кровью, флакон ставят в термостат. Посев гемолизированной крови позволяет выявить бактериемию в ряде случаев, тогда когда на других средах роста нет. Высвобождение микроорганизмов, адсорбированных на эритроцитах или подвергшихся незавершенному фагоцитозу, а также снижение антибактериальной активности гемолизированной крови, делает эту среду особенно ценной при заболевании, для которого характерна незавершенность фагоцитарной реакции.
4. Полужидкая среда Тароцци с 0,5% глюкозы и 0,1% агара во флаконах по 300 или 150 мл. Во флаконы сеют 5 мл и 3 мл крови (соответственно количеству среды) (см. раздел 3.2).
5. Жидкая среда Сабуро служит для выявления грибковых септических состояний.
Приготовление: на 1 литр дистиллированной воды берут 10 г пептона, 25 г хлористого натрия, 40 г глюкозы. Разливают во флаконы по 150-200 мл, стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут (pH 5,5). В жидкую среду Сабуро засевают 3-4 мл крови.
Культивирование. Засеянные кровью среды инкубируют в течение 6 недель в термостате при 37°C. Просматривают ежедневно в течение первых 8 дней. При появлении видимого роста делают мазки, окрашивают их по Граму, и, в соответствии с данными бактериоскопии, делают высевы на среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам и проводят идентификацию выделенных бактерий. При подозрении на анаэробную флору делают параллельные высевы для культивирования в аэробных и анаэробных условиях.
При отсутствии видимого роста на 3, 5, 8 день из всех сред, кроме "двойной среды" и "среды для контроля стерильности", делают высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром и мазки на стеклах, которые окрашивают по Граму. Посевы на чашках инкубируют при 37°C в аэробных или анаэробных условиях соответственно предположительному заключению о характере флоры в мазках по Граму. Выращенные бактерии идентифицируют, определяют их свойства, чувствительность к антибактериальным препаратам, фагам и т.п.
При отсутствии роста на 9-10 день дают отрицательный ответ. Однако флаконы с засеянной средой выбрасывать не рекомендуется. Необходимо продолжать держать их в термостате в течение 4-6 недель, проверяя появление роста 2-3 раза в неделю. За это время может быть выявлен замедленный рост персистирующих бактерий, бактерий в L-форме и т.п. При этом, если флаконы закрыты ватно-марлевыми пробками, их нужно запарафинировать смесью воска (1/3) и парафина (2/3) для предотвращения высыхания среды. При отсутствии на средах видимого роста микроорганизмов в первые двое суток следует особенно строго соблюдать правила, обеспечивающие стерильность, т.к. возможность попадания посторонней флоры во время повторных пересевов возрастает с каждым последующим пересевом.
