8.1 Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР
8.1.1 Для каждой анализируемой пробы готовят две чистых микроцентрифужных пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 см
, маркируя их "N
" и "N
", где N - номер анализируемой пробы.
8.1.2 Реакционные смеси для амПЦР "М1" и "М2", полученные по 7.3.1.1-7.3.1.2, микродозатором вносят в микроцентрифужные пробирки по 20 мм в каждую таким образом, чтобы смесь "М1" была распределена по пробиркам с индексом "N", а смесь "М2" - по пробиркам с индексом "N".
8.1.3 Анализируемую ДНК пробы N, выделенную по 7.2, вносят микродозатором по 5 мм в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР (см. 8.1.2), маркированные, соответственно, "N" и "N". При использовании амплификатора ДНК без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм вазелинового масла для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы.
8.1.4 В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль).
8.1.5 Затем еще в две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).
8.1.6 Все микроцентрифужные пробирки со смесями, подготовленными по 8.1.3-8.1.5, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.
Таблица 2
| | | |
Шаг программы
| Температура, °С
| Время инкубации
| Число циклов
|
1
| 95
| 12 мин
| 1
|
2
| 95
| 30 с
| 55
|
| 51
| 30 с
| |
| 72
| 30 с
| |
3
| 72
| 10 мин
| 1
|
8.2 Гибридизация на биологическом микрочипе
8.2.1 Для проведения этапа гибридизации готовят N+2 микроцентрифужных пробирки вместимостью 0,5 или 1,5 см (N - количество анализируемых проб, две другие пробирки - для анализа положительного и отрицательного контроля).
8.2.2 В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 18 мм гибридизационного буфера (см. 5.36). К гибридизационному буферу в пробирку "N" добавляют по 9 мм водной фазы ПЦР-смесей из пробирок "N" и "N", полученных в результате проведения амПЦР (см. 8.1.6) и перемешивают в течение 20-30 с на аппарате для встряхивания (см. 5.10) с частотой вращения не менее 1500 мин
для получения гибридизационной смеси.
8.2.3 Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 34 мм гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 8.2.2. Смесь вносят через любое из двух отверстий гибридизационной камеры, после чего оба отверстия закрывают крышкой. Гибридизацию проводят в термостате (см. 5.4) при температуре 37°С. Минимальное время гибридизации составляет 3 ч. Допускается гибридизация в течение ночи, но не более 16-18 ч.
8.2.4 После окончания гибридизации крышку реакционной камеры открывают и микродозатором отбирают гибридизационную смесь из камеры микрочипа. В любое из двух отверстий камеры вносят 34 мм дистиллированной воды по ГОСТ 6709, предварительно нагретой до температуры 37°С. Воду выдерживают в реакционной камере биологического микрочипа в течение 1 мин, затем отбирают микродозатором и отбрасывают. Процедуру повторяют, после чего составную крышку отсоединяют от подложки. Подложку последовательно промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709, этиловым спиртом (см. 5.28), снова дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.
Схема метода идентификации генно-модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в приложении А.
