МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ

     
(с изм., внесенными Методическими указаниями, утв. Минздравом СССР 19.02.1981 N 2293-81, МУ 2.1.7.730-99, утв. Минздравом РФ 07.02.1999)

Утверждаю

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР В.Е.КОВШИЛО 4 августа 1976 г. N 1446-76

Санитарная охрана почвы, как одного из важнейших объектов окружающей среды, в настоящее время имеет актуальное значение. В первую очередь это связано с тем, что несмотря на профилактические мероприятия, проводимые в нашей стране и за рубежом, заболеваемость кишечными инфекциями бактериальной и вирусной природы остается на высоком уровне, что в значительной степени обусловлено циркуляцией в окружающей среде патогенных энтеробактерий и кишечных вирусов.

Однако, чтобы своевременно ограничить циркуляцию в окружающей среде патогенных микроорганизмов за счет проведения профилактических мероприятий, необходимо иметь высокочувствительные и доступные широкой практике методы их обнаружения в объектах внешней среды, в том числе и в почве.

Широкое использование ядохимикатов в сельском хозяйстве обусловливает значительное загрязнение ими почвы. При этом в силу физико-химических особенностей почвы, процессов сорбции в ней создаются условия для накопления пестицидов и тесного контакта их остаточных количеств с микрофлорой. В литературе накоплен значительный материал о различном неблагоприятном воздействии химических токсических веществ на микроорганизмы. В этих условиях перед санитарно-эпидемиологической службой появляется ряд новых задач, увеличивающих объем исследований почвы по санитарно-микробиологическим показателям. Так, изучение влияния химических веществ на процессы самоочищения почвы, почвенный микробиоценоз, на выживаемость кишечных микробов в почве является одним из этапов гигиенического нормирования вредных химических веществ в почве.

В изданных за последние годы руководствах и сборниках по санитарной микробиологии и гигиене почвы (1-2, 4-7) практически повторяется инструкция по санитарно-бактериологическому исследованию почвы населенных мест (1958). В настоящее время получены новые данные по усовершенствованию методов обнаружения в почве патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, которые можно рекомендовать для практической санитарной службы.

Настоящие Методические указания предназначены для использования санитарно-бактериологическими лабораториями санитарно-эпидемиологических станций, осуществляющих контроль за санитарным состоянием почвы, микробиологами научно-исследовательских учреждений и производственных лабораторий, изучающих влияние химических веществ на микрофлору почвы в плане их нормирования.

I. СХЕМА И САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЫ

В настоящих Методических указаниях приведен полный набор микробиологических показателей и методов их определения, использование которых позволяет дать комплексную санитарно-микробиологическую оценку почвенного покрова. Одни показатели (бактерии группы кишечных палочек, термофильные, нитрифицирующие, общее количество бактерий и Cl. perfringens) указывают на степень фекального загрязнения. Изучение состояния почвенного биоценоза по этим показателям и дополнительно по ряду групп и видов почвенной микрофлоры позволяет более глубоко определять изменения в почве, происходящие в результате бактериального, органического и химического загрязнений.

В соответствии с целями исследований в каждом конкретном случае можно использовать определенную группу показателей. В таблице 1 приведены 4 группы показателей. При проведении текущего санитарного надзора за состоянием почвы целесообразно ограничить исследования проведением краткого санитарно-микробиологического анализа, указывающего на наличие и степень фекального загрязнения почвы. По показателям, включенным в эту группу, можно определять и самоочищение почвы от энтеробактерий и органических веществ.

Таблица 1

     
СХЕМА САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЫ

Исследование почвы по полному санитарно-микробиологическому анализу показано при осуществлении предупредительного санитарного надзора при выборе территорий для размещения населенных пунктов, отдельных объектов, ЗПО и др., а также при проведении научных исследований. Проведение анализа почвы по полной схеме позволяет получать наиболее полные данные о степени фекального и органического загрязнения и течении процессов самоочищения.

Определение влияния химических веществ на почвенный биоценоз предусматривает дополнительные исследования, позволяющие дать более быструю характеристику антибактериального действия химических соединений, а также их действия на активность почвенной микрофлоры.

В необходимых случаях, а также по эпидемическим показаниям можно проводить индикацию и выделение из почвы патогенных микроорганизмов, в распространении которых почва играет важную роль.

II. ОЦЕНКА САНИТАРНОГО СОСТОЯНИЯ ПОЧВЫ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

Имеющиеся в литературе данные (1, 2, 3) и исследования, проведенные Молдавским НИИ гигиены и эпидемиологии, позволили разработать схему оценки санитарного состояния почвы по 4-м микробиологическим показателям (табл.2).

Таблица 2

     
СХЕМА ОЦЕНКИ САНИТАРНОГО СОСТОЯНИЯ ПОЧВЫ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

Наличие кишечной палочки в титрах 0,9 и ниже свидетельствует о несомненном фекальном загрязнении почвы, притом свежем. Одновременно могут быть зарегистрированы низкие титры Cl. perfringens и нитрификаторов. Однако следует иметь в виду, что в первое время после имевшего место органического загрязнения нитрификаторов может быть мало - необходимо время, чтобы они успели размножиться.

В процессе самоочищения на разных этапах возникают различные количественные соотношения этих показателей. Наиболее быстро отмирает кишечная палочка, поэтому при сравнительно высоких ее титрах титры Cl. perfringens и нитрифицирующих бактерий низкие. Это показывает, что в почве интенсивно протекают процессы самоочищения как от патогенных микроорганизмов, так и от органического загрязнения.

Высокий титр (1,0 и выше) кишечной палочки при низких титрах остальных 3-х показателей характеризует почву как свободную от возбудителей кишечных инфекций, но в которой еще не закончились процессы распада и минерализации органических веществ.

Высокие титры всех показателей свидетельствуют о законченных процессах самоочищения и характеризуют почву как чистую, свободную от патогенных энтеробактерий и органических загрязнений.

Эти моменты имеют важное значение при определении не только фактического санитарного состояния почвы определенных территорий, но и для выяснения стадий течения процесса самоочищения, установления сроков полива, удобрения почвы навозом и т.д.

О загрязнении почвы навозом и компостами свидетельствует повышенное содержание в ней термофилов (более 1000 клеток в 1 г почвы).

Дополнительным показателем является общее количество бактерий в грамме почвы. Единого норматива этого показателя нет, так как количество бактерий в почвах разных типов и климатических районов сильно варьирует. Для подзолистых почв наличие 10 млн. бактерий в грамме почвы и более указывает на фекальное загрязнение. Для других типов почв необходимо устанавливать конкретные нормативы этого показателя.

Приведенная выше схема позволяет оценивать санитарное состояние почвы в 2-х аспектах: загрязнения патогенными энтеробактериями и органическими веществами. Причем исследования, проведенные в ИОКГ им.А.Н.Сысина, Молдавском НИИ гигиены и эпидемиологии и в Киевском НИИ ОКГ им.А.Н.Марзеева, показали, что основной косвенный показатель - численность кишечных палочек - является надежным индикатором фекального загрязнения почвы и при загрязнении ее химическими веществами. Вышеизложенное позволяет рекомендовать эту схему для оценки санитарного состояния почвы независимо от того, загрязнена она химическими веществами или нет.

Косвенные микробиологические показатели не указывают на наличие или отсутствие в почве других возбудителей инфекционных заболеваний (столбняка, сибирской язвы, ботулизма), кишечника и других вирусов, патогенных для человека.

Для выделения или индикации этих патогенных микроорганизмов необходимо проводить специальные исследования с использованием лабораторных животных в крупных бактериологических лабораториях или научных учреждениях. Описание этих методик приводится ниже в соответствующих разделах Методических указаний.

В санитарно-бактериологических лабораториях районных санэпидстанций можно проводить исследование почв на присутствие тифопаратифозных и сальмонеллезных возбудителей. Необходимость в проведении таких анализов возникает при расследовании вспышек, при установлении источника заражения, а также при проведении противоэпидемических мероприятий.

III. ОТБОР ПРОБ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

     
Санитарное обследование, выбор точек отбора проб

Увеличение количества источников загрязнения почвы привело к необходимости увеличения объема работы по санитарной охране почвы. В настоящее время санитарному надзору подлежат не только территории населенных мест, но и за их пределами.

Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов санитарного надзора с применением санитарно-микробиологических методов исследования и требующими проведения ряда мероприятий по предотвращению загрязнения почвы, являются: детские и лечебно-профилактические учреждения; сельские и неканализованные районы городских населенных пунктов; территории первого пояса зоны санитарной охраны источников хозяйственно-питьевого водоснабжения; зоны свалок, отвальных площадок; сельскохозяйственные поля, орошаемые водой из открытых водоемов, стоками животноводческих ферм и комплексов и удобряемые навозом; земледельческие поля орошения городскими и промышленными сточными водами, а также при внесении их осадков в качестве удобрения.

Обязательным предварительным этапом при санитарно-бактериологическом исследовании почвы является санитарное обследование. Суть его заключается в том, что санитарный врач на основании предварительно составленной карты санитарного обследования визуально и в результате опроса описывает изучаемую территорию, выбирает на ней точки взятия проб, участвует в отборе проб. В Приложении 1 дан примерный образец карты санитарного обследования земельного участка.

На основании результатов санитарного обследования территории и ее описания составляется схематический план земельного участка с нанесением источников загрязнения. Это позволяет правильно обосновать выбор точек отбора проб почвы.

На изучаемой территории при наличии одного источника загрязнения выделяют два участка, 25 м каждый; один вблизи источника загрязнения (опытный), другой - вдали (контрольный). Контрольный выбирают с таким расчетом, чтобы он был заведомо незагрязненный и имел одинаковый почвенный состав с опытным.

Если на изучаемой территории имеется несколько источников загрязнения, то необходимо выделить несколько опытных участков около каждого загрязняющего внешнюю среду объекта. Если на территории нет видимых источников загрязнения, то необходимо выделить участки согласно элементам рельефа.

При санитарно-бактериологическом обследовании почвы значительных территорий определение количества точек для забора проб почвы производится согласно следующим рекомендациям. На каждые 100 га изучаемой территории при спокойном рельефе местности намечают к отбору проб почвы 6-7 участков площадью 25 м. При выраженном рельефе количество отводимых участков увеличивается до 8-10.

Отбор образцов почвы

Пробы почвы отбираются на каждом из участков в его пяти точках по диагонали или по "конверту" (четыре точки по углам и одна в центре).

В том случае, если исследователя интересуют последствия непосредственного внесения химического вещества в почву, пробы отбираются поверхностно (0-1 см) стерильным инструментом (нож, шпатель) в количестве 0,3-0,5 кг в одной точке.

Если изучается воздействие химического вещества на микрофлору почвенного горизонта, то для отбора проб почвы пользуются следующей методикой. Каждая точка, в которой проводится отбор проб почвы, представляет собой центр выбранного для исследования 1 м территории. Здесь выкапывается прикопка (шурф) размером в плане 0,3 м0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской. Так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см3 см3 см, 500 г - 20 см5 см 3 см.

При изучении воздействия пестицидов и др. химических веществ на микрофлору и процессы самоочищения в более глубоких слоях почвы для отбора проб почвы пользуются шурфом глубиной до 1 м. Пробы отбираются из стенки шурфа стерильным инструментом через каждые 10 см.

В тех случаях, когда исследователя интересует влияние химических веществ на микрофлору почвы и процессы самоочищения в более глубоких слоях почвы, не имеет большого смысла отбирать пробы почвы, а следует производить изучение грунтовых вод, отбираемых с помощью прибора Гончарука.

Отобранные образцы помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию. При невозможности приступить к исследованию почвы немедленно допускается хранение образца при температуре 4-5°, но не более 24 часов.

Подготовка и обработка почвы для анализа

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Если проба почвы однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы.

Перед посевом почву диспергируют. С этой целью почву с соблюдением условий стерильности просевают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито покрывают сверху стерильной бумагой. Почву дисперсную можно не подвергать просеиванию. Почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке. Неперегнившую растительную массу отбрасывают.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов и энтеровирусов достаточно навески от 1 до 10 г, для санитарно-показательных микроорганизмов от 1 до 30 г, для патогенных энтеробактерий (50-55,5 г). Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя стерильную водопроводную воду в соотношении 1:10 к весу почвы (например: 1 г почвы разводят в 10 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы - в 100 мл воды и т.д.). После приготовления навески применяют соответствующую предварительную обработку почвы в зависимости от типа и вида учитываемого микроорганизма. Основная цель, которую преследуют проводя предварительную обработку почвы, заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц.

Основными приемами предварительной обработки почвы являются: 1) 10-минутное вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками - при навеске почвы 1 г; 2) 3-минутная обработка почвенной суспензии первого разведения на мешалке механического диспергатора (размельчитель тканей, марки РТ-2) - при навеске почвы более 1 г.

Почвенную суспензию, содержащую в 1 мл 0,1 г почвы, через 30 секунд после предварительной обработки (за это время оседают грубые минеральные частицы) используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Для этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г/мл отбирают стерильной пипеткой 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 г/мл почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001-0,00001 г/мл. Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки.

Приготовленные децимальные разведения используются для посева почвы на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.

Для определения отдельных показателей применяются и другие способы обработки, описание которых приводится ниже в соответствующих разделах.

Для получения сравнимых и более полных результатов желательно производить пересчет количества обнаруживаемых микроорганизмов на 1 г абсолютно сухой почвы. Для этого необходимо производить определение влажности анализируемого образца почвы. С этой целью навеску почвы (10-20 г) помещают в заранее взвешенный стеклянный или металлический бюкс и высушивают в сушильном шкафу при 105°С. Первое контрольное взвешивание высушенной почвы делают через 3 часа, затем высушивают почву до постоянного веса (контрольное взвешивание каждые 2 часа). Расчет производится по следующей формуле:

,*

N - количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы;

Nc - количество клеток бактерий в г сырой почвы;

а - степень десятикратного разведения;