МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ

УТВЕРЖДЕНЫ Заместителем Главного Государственного санитарного врача СССР В.Е.Ковшило 19 февраля 1981 г. N 2293-81

Настоящие методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы являются дополнением к методическим указаниям, выпущенным МЗ СССР в 1977 г. Последние сыграли положительную роль в развитии работ по санитарно-микробиологическому исследованию почв, в частности, способствовали усилению контроля за санитарным состоянием почвы, явились методической основой для широкого фронта работ по гигиеническому нормированию химических веществ в почве. Содержащиеся в них методы прошли широкую практическую апробацию в самых различных учреждениях страны, хорошо зарекомендовали себя и рекомендуются для дальнейшего использования в соответствии с требованиями указаний 1977 г. Вместе с тем, проведенные за 1976-1980 гг. экспериментальные и натурные методические разработки ряда авторов позволили предложить с целью дальнейшего совершенствования методических указаний, в виде дополнений, ряд методов по их основным разделам.

IV. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ

     
IV.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ,
ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ ФЕКАЛЬНОЕ ЗАГРЯЗНЕНИЕ ПОЧВЫ

     
Определение количества энтерококков в почве

Количество энтерококков в почве может считаться наряду с определением БГКП показателем фекального загрязнения. На основе многократных исследований можно судить о поведении энтерококков в почве, а следовательно характеризовать процесс самоочищения почвы от фекального загрязнения. Рекомендуются для определения энтерококков в почве следующие три метода: 1) титрационный; 2) прямой поверхностный посев; 3) капельный метод.

Первоначальные этапы определения энтерококков в почве, такие как отбор проб почвы, хранение и подготовка почвы к анализу, приготовление почвенной суспензии, предварительная обработка почвы, приготовление децимальных разведений - будут одинаковыми, независимо от того, какой будет применен в дальнейшем метод: прямой посев, титрационный или капельный.

Методы обнаружения энтерококков в почве

Отбор проб почвы для обнаружения энтерококков, подготовка почвы к анализу и приготовление почвенной суспензии осуществляется в соответствии с требованиями "Методических указаний по санитарно-микробиологическому анализу почвы", 1977 г., с.8-13. Отобранные пробы почвы можно хранить в течение 3 суток в холодильнике при +3 - +5 °С, не допуская при этом подсушивания почвенных проб.

Наиболее эффективным приемом предварительной обработки почвенной суспензии является озвучивание ее низкочастотным ультразвуком (на отечественном диспергаторе УЗДН-1, частота 22 кгц, интенсивность 44 вт/см, сила тока 0,44 А в течение 1 мин с использованием экспоненциального излучателя). Однако, учитывая недостаточную техническую оснащенность ряда лабораторий, допустима обработка почвенной суспензии путем встряхивания в пробирках или обработка на РТ-2.

При использовании последних двух приемов десорбции, при окончательном расчете энтерококков на 1 г почвы, необходимо внести поправку, увеличив полученные данные на 37%, т.к. при механической обработке указанное количество энтерококков недоучитывается. Приготовление децимальных разведений почвенной суспензии проводят по стандартной методике.

При анализах почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения посев проводится титрационным методом из децимальных разведений почвенной суспензии в жидкую среду ЩЭС (температура инкубации 37 °С) с последующим через 24 часа высевом на подтверждающую среду Г.П.Калины. Учет анализов производится через сутки с перерасчетом результатов на 1 г почвы по таблицам НВЧ с учетом влажности.

Сильно загрязненные почвы можно анализировать проводя посев в жидкую среду ЩЭС, как описано выше или стандартным поверхностным методом на плотную среду Сланца-Бертли или капельным методом*. В дальнейшем также делают перерасчет количества определяемых энтерококков на 1 г почвы с учетом влажности и определяют среднюю ошибку опытов.

________________

* Описание приводится в следующем разделе.

Капельный метод посева

Для учета в загрязненных почвах бактерии группы кишечных палочек, энтерококков*, общей численности микроорганизмов, споровых бактерий и актиномицетов рекомендуется использование капельного метода посева в упрощенной модификации. Данная методика удобна в полевых экспедиционных условиях, а также при проведении опытов по установлению гигиенических нормативов химических веществ в почве.

________________

* Рекомендуется для оценки фекального загрязнения и для характеристики самоочищения почвы от органических и химических загрязнений.

На поверхность плотной, хорошо высушенной соответствующей среды в чашки Петри наносят микропипеткой по 6-10 капель (0,01 мл) из децимальных разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную подготовку. Некоторое время посевы выдерживают на столе, до подсыхания капель, а затем помещают в термостат крышкой вверх. При работе этим методом нужно строго соблюдать режим подсушивания плотных сред в чашках Петри: подсушивание проводят не менее 1 часа при 60-70° или 1 сутки при комнатной температуре (18-20 °С) до получения "муаровой пленки".

IV.3*. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ХИМИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

_______________
     * Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Ускоренный культурально-морфологический метод установления
влияния химических веществ на микроорганизмы

Сущность метода заключается в наблюдении под микроскопом с фазовым контрастом за ростом и размножением чистых культур микроорганизмов на специально приготовленных агаровых пластинках. Питательные среды, соответствующие для изучаемых видов микроорганизмов, расплавляют и разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Расчет рабочих концентраций химических веществ производится следующим образом: не больше 1 мл раствора на 10 мл питательной среды. Одна пробирка каждой серии является контрольной - без химических соединений. После внесения химических веществ все пробирки ставят на водяную баню, для поддержания температуры в пределах 50-70 °С. Чистые предметные стекла прожигают над пламенем горелки, затем на них из пробирок наносят тонкий слой (0,5-1 мм) питательной среды. Параллельно, на покровное стекло пастеровской пипеткой наносится небольшая капля суспензии клеток тест-микроорганизма определенной концентрации (для энтеробактерий оптимальная концентрация 200 млн/мл, для дрожжей - 50 млн/мл). Покровное стекло с нанесенной каплей бактериальной взвеси переворачивается и опускается на поверхность тонкого слоя агара. Капля под покровным стеклом растекается на всю его площадь. Результаты проведенных опытов показали, что для получения ответа на статистически достоверном уровне достаточно просмотреть один препарат при подсчете не менее 100 микроколоний и единичных клеток. Наблюдение под микроскопом производится после инкубирования в термостате в течение времени, необходимого для каждого вида микроорганизмов и охлаждения их в холодильнике при температуре 6-10 °С в течение 10-15 мин. Из термостата вынимают все слайды (опытные и контрольные) одновременно. Просмотр проводят по диагонали препарата с увеличением 40х7. При таком увеличении в поле зрения попадает 20-25 клеток, которые легко поддаются учету.