ГОСТ 33163-2014 Продукция соковая. Определение бактерий рода Alicyclobacillus
9 Подтверждение принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям рода Alicyclobacillus*
________________
* Слово "Alicyclobacillus" в наименовании раздела 9 в бумажном оригинале выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.
9.1 Для дальнейшего подтверждения выделенных культур изучают их отношение к окраске по Граму, способности к росту при 3,7 ед. рН и способности к образованию гваякола (пероксидазный тест, см. приложение Б).
9.2 Определение способности к росту при 3,7 ед. рН
9.2.1 Из каждой выбранной колонии засевают штрихами по ГОСТ ISO 7218 по одной чашке Петри с нейтральной средой (например, мясопептонным агаром, триптическим соевым агаром), К агаром, ВАТ-агаром и две чашки с YSG-агаром.
9.2.2 Термостатируют посевы на нейтральной среде, К-агаре и ВАТ-агаре и YSG-агаре при температуре (45±1)°С в течение 3-5 сут. Вторую чашку с посевом на среде YSG-агар термостатируют при температуре (65±1)°С в течение 2-3 сут.
9.2.3 На нейтральной среде рост бактерий рода Alicyclobacillus не наблюдается. Если в этой среде отмечен рост колоний, то они не относятся к роду Alicyclobacillus.
Результат подтверждения - отрицательный.
9.2.4 Если рост колоний на К-агаре при температуре 45°С отсутствует, то рост колоний проверяют на YSG-агаре при той же температуре.
Вероятность того, что вызывающие порчу штаммы бактерий рода Alicyclobacillus будут расти на YSG-агаре при температуре (65±1)°С, минимальна. Если при температуре 65°С наблюдается рост колоний, то они не относятся к роду Alicyclobacillus.
Результат подтверждения - отрицательный.
9.3 Окраска по Граму
Приготовление мазков из культур, выросших на поверхности питательных сред, и окраску их по Граму проводят по ГОСТ 30425.
Бактерии рода Alicyclobacillus - грамположительные палочки*.
_______________
* Возможна вариабельность (неоднородность) окрашивания для культур более 24 ч.
9.4 Проверка наличия спорообразования
9.4.1 Проверяют культуры, выросшие на ВАТ-агаре, на наличие у них спорообразования путем просмотра с помощью фазово-контрастной микроскопии живого препарата, приготовленного методом раздавленной капли или путем окрашивания препаратов по Граму по ГОСТ 30425 или используют специальные красители для спор по ГОСТ 30425.
На YSG-агаре спорообразование бактерий рода Alicyclobacillus не происходит. Для подтверждения наличия спор используют ВАТ-агар, со значением рН менее 4 ед. рН, чтобы исключить рост прочих кислотоустойчивых спорообразующих бактерий, например, В. coagulans.
Если в приготовленных препаратах с ВАТ-агара спор не обнаружено, то для инициации образования спор проводят прогрев суспензий обнаруженных микроорганизмов (тепловой удар) по 8.1.3. После прогрева 0,1-0,2 см суспензии высевают на поверхность ВАТ-агара. Посевы термостатируют по 8.1.5, затем готовят из выросших культур препараты для определения наличия спор.
9.5 Колонии, которые образуют споры при 3,7 ед. рН и не растут при рН выше 6 ед. рН и температуре 65°С, идентифицируют как предполагаемые штаммы Alicyclobacillus.
9.6 Проведение пероксидазного теста на гваякол (дополнительный тест)
Чашку с YSG-агаром (после культивирования при 45°С) сохраняют для пероксидазного теста на выявление гваякола (см. приложение Б).
По результатам дополнительного подтверждения к бактериям рода Alicyclobacillus относят факультативно-анаэробные, образующие споры грамоположительные палочки, дающие положительную реакцию на гваякол.
9.7 Схемы выявления бактерий рода Alicyclobacillus в соковой продукции приведены в справочных приложениях В и Г*.
_______________
* В приложениях В и Г при выявлении и определении количества спор бактерий рода Alicyclobacillus в концентрированной и готовой соковой продукции проводят посев пробы соковой продукции, подвергнутой тепловому удару.