ГОСТ 32634-2014

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro

OECD guidelines for the testing of chemicals. In vitro skin corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RhE) test Method

 МКС 13.020.01

Дата введения 2015-06-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ" (ФГУП "ВНИЦСМВ"), Техническим комитетом по стандартизации ТК 339 "Безопасность сырья, материалов и веществ" на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 28 марта 2014 г. N 65-П)

За принятие стандарта проголосовали:

4  Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 сентября 2014 г. N 1229-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32634-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2015 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD, Test No. 431:2004* "Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro" ("In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Method", IDT).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ИЗДАНИЕ (май 2019 г.) с Поправкой* (ИУС 5-2015)

________________

* См. ярлык "Примечания".     

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Разъедание/коррозия кожи является последствием необратимых повреждений тканей после нанесения исследуемого вещества [в соответствии с определением Согласованной на Глобальном уровне Системы классификации и маркировки химических веществ (СГС)] [2]. Настоящее руководство не предусматривает использования животных или тканей животных для исследования разъедания/коррозии кожи, in vitro.

Испытания на разъедание/коррозии кожи, как правило, были связаны с использованием лабораторных животных [3]. Вопросы благополучия животных, используемых в данной процедуре, были рассмотрены в 2002 году в пересмотренном Руководстве 404 и дополнении к Руководству 404, разработанных для проведения испытаний с использованием альтернативных in vitro методов, исключающих боль и страдания животных.

Основным препятствием на пути полной замены in vivo испытания на разъедание/коррозию кожи в Руководстве 404 было отсутствие формальных и независимых проверочных in vitro методов. Первым шагом к разработке альтернативных методов, которые могут быть использованы для испытания разъедания/коррозии кожи в нормативных целях, было проведение предварительных оценочных исследований [4]. После этого было проведено [7], [8], [9] формальное проверочное исследование in vitro методов для оценки разъедания/коррозии кожи [5], [6]. В результате данных исследований и других исследований, описанных литературе [10], для оценки разъедания/коррозии кожи [11], [12], [13], [14] были рекомендованы следующие тесты: испытание на модели кожи человека (реконструированный эпидермис [RhE]) (настоящий стандарт) и испытание кожного электрического сопротивления (Руководство 430).

Проверочные исследования показали, что тесты на модели кожи человека [4], [5], [6], [10] позволяют надежно идентифицировать известные разъедающие/коррозионные и некоррозионные для кожи вещества. Испытание также может дать представление о различной степени воздействия разъедающих/коррозионных веществ.

     1 Область применения

Представленный в настоящем стандарте метод испытаний позволяет идентифицировать разъедающие/коррозионные химические вещества и смеси. Кроме того, метод позволяет выявлять некоррозионные вещества и смеси при наличии следующей доступной информации (например, pH, зависимость "структура-активность", данные о воздействии на человека и/или животных) [2], [3], [14], [15]. В общем случае, метод не позволяет идентифицировать вещества, раздражающие кожу, а также провести классификацию коррозионных веществ в соответствии с Согласованной на Глобальном уровне Системой классификации и маркировки химических веществ (СГС) [2].

Для полной оценки местных кожных реакций при однократном нанесении исследуемого вещества на кожу рекомендуется использовать последовательную стратегию тестирования в соответствии с приложением к Руководству 404 [3] и СГС [2]. Данная стратегия проведения испытаний включает в себя проведение испытания in vitro на разъедание/коррозию кожи (как описано в настоящем стандарте) и раздражение кожи до проведения испытаний на животных.

     2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 жизнеспособность клетки (cell viability): параметр для измерения суммарной активности клеточной популяции (например, способность клеточных митохондриальных дегидрогеназ потреблять витальный краситель МТТ), который, в зависимости от измеряемого конечного показателя и протокола испытания коррелирует с общим числом и/или жизнеспособностью клеток.

2.2 разъедание/коррозия кожи in vivo (skin corrosion in vivo): необратимые повреждения кожи, в частности видимый некроз эпидермиса с последующим повреждением дермы, возникающие в течение четырех часов после нанесения исследуемого вещества. Коррозионные реакции идентифицируют по появлению язв, кровотечений, кровавых струпьев, а по окончании периода наблюдений, 14 дней, по изменению цвета кожи вследствие побледнения, появлению участков выпадения волос (алопеции) и шрамов.

Для оценки сомнительных поражений необходимо проводить гистопатологическое исследование.

     3 Принцип метода испытания

Исследуемое вещество наносится местно на трехмерную модель человеческой кожи (RhE), состоящую, как минимум, из реконструированного эпидермиса с функциональным роговым слоем. Коррозионные вещества определяются по их способности вызывать снижение жизнеспособности клеток (которое определяется, например, с помощью МТТ-теста [16]) ниже определенного порогового уровня за определенные периоды воздействия. Принцип испытания на модели человеческой кожи основан на гипотезе, что коррозионные химические вещества могут проникать в роговой слой кожи путем диффузии или эрозии и оказывают цитотоксическое действие на нижележащие слои клеток.

     4 Описание метода

4.1 Модели кожи человека

Модели человеческой кожи могут быть сконструированы или приобретены на коммерческой основе (например, модели EpiDerm™ и EPISKIN™) [17], [18], [19], [20] или разработаны и построены в испытательной лаборатории [21], [22]. Считается, что использование кожи человека зависит от национальных и международных этических стандартов и условий. Любая новая модель должна быть проверена (по крайней мере, в степени, описанной в разделе 4.2). Модели кожи человека, используемые для данного испытания, должны соответствовать следующим параметрам:

4.2 Общие параметры модели

Для построения эпителия должны быть использованы кератиноциты человека. Под функциональным роговым слоем должны быть расположены несколько слоев жизнеспособных эпителиальных клеток. Модель кожи также может иметь стромальный слой. Роговой слой должен состоять из нескольких слоев с необходимым липидным профилем для создания функционального барьера, достаточно устойчивого для проникновения цитотоксических маркеров. Сдерживающие свойства модели должны препятствовать прохождению исследуемого материала через роговой слой в жизнеспособные ткани. Прохождение исследуемого вещества через роговой слой приведет к получению недостоверной имитации воздействия на кожу. Модель не должна быть загрязнена бактериями (в том числе, микоплазмой) или грибками.

4.3 Функциональные параметры модели

Величина жизнеспособности, как правило, определяется количественно с использованием МТТ или других витальных красителей, реагирующих на метаболические превращения. В таких случаях оптическая плотность (ОП) экстрагированного (растворенного) красителя из ткани в негативном контрольном эксперименте должна не менее чем в 20 раз превышать оптическую плотность самого экстрагента (растворителя) (для дополнительной информации см. [23]). Ткани для негативного контрольного эксперимента должны быть стабильными в культуре (для обеспечения подобия оценки жизнеспособности клеток) в течение всего периода воздействия. Роговой слой должен быть достаточно надежным, чтобы противостоять быстрому проникновению некоторых цитотоксических химических маркеров (например, 1% Тритон Х-100). Данное свойство может быть оценено по времени воздействия, необходимому для снижения жизнеспособности клеток на 50% () (например, для моделей EpiDerm™ и EPISKIN™ данное время составляет более двух часов). Модель должна демонстрировать воспроизводимость в течение долгого времени и желательно при проведении испытаний в разных лабораториях. Кроме того, используемая модель должна давать возможность прогнозирования коррозионного потенциала стандартных химических веществ (см. таблицу 1) при использовании выбранного протокола испытаний.

4.4 Нанесение исследуемого и контрольного вещества

Для каждого испытания (времени экспозиции), в том числе контрольного, используют два образца ткани. При исследовании жидких веществ достаточное количество исследуемого вещества наносят равномерно на образец для полного покрытия поверхности кожи; необходимо использовать не менее 25 мкл/см. При исследовании твердых веществ, достаточное количество исследуемого вещества равномерно наносят на образец для покрытия поверхности кожи. При этом исследуемое вещество должно быть смочено деионизированной или дистиллированной водой для обеспечения хорошего контакта с кожей. В случае необходимости, перед нанесением твердые вещества можно измельчить. Нанесение вещества должно осуществляться приемлемым методом (см. [6]). По окончании периода воздействия исследуемое вещество должно быть тщательно смыто с поверхности кожи соответствующим буферным раствором или 0,9% раствором NaCI.

Для подтверждения надлежащего действия экспериментальных моделей в каждом испытании должны использоваться параллельные положительные и отрицательные контрольные образцы. Для положительного контрольного испытания рекомендуется использовать ледяную уксусную кислоту или 8 н. KОН, для отрицательного - 0,9% раствор NaCI или воду.

4.5 Измерения жизнеспособности клеток

Для оценки жизнеспособности клеток могут использоваться только подтвержденные количественные методы. Кроме того, метод оценки жизнеспособности должен быть совместим с использованием трехмерной модели. Неспецифическое связывание белка красителем не должно мешать измерению жизнеспособности клеток. Таким образом, красители, связывающие белок или не подвергающиеся метаболическим преобразованиям (например, нейтральный красный), не подходят для использования в испытании. Наиболее часто используются краситель МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид, тиазолил синий, номер CAS 298-93-1)], для которого были получены точные и воспроизводимые результаты [6]. Другие красители также могут использоваться. Образец кожи помещают в раствор МТТ соответствующей концентрации (например, 0,3-1 мг/мл) и выдерживают при необходимой температуре в течение 3 ч. Осажденный синий формазан затем экстрагируют с помощью растворителя (изопропанола), а концентрацию формазана измеряют путем определения оптической плотности при длине волны от 540 до 595 нм.

Химическое действие исследуемого вещества на витальные красители может имитировать действие клеточного метаболизма, что приводит к ложной оценке жизнеспособности. Было показано, что это происходит в случае неполного удаления исследуемого вещества с образца кожи [10]. Если исследуемое вещество непосредственно воздействует на витальный краситель, для обнаружения и корректировки вмешательства исследуемого вещества в оценку жизнеспособности клеток должны быть использованы дополнительные контрольные процедуры [10], [24].

     5 Интерпретация результатов

Значения оптической плотности, полученные для каждого образца, могут быть использованы для расчета процента жизнеспособности по сравнению с отрицательным контрольным значением, которое произвольно устанавливается на уровне 100%.

Пороговое значение жизнеспособности клеток в процентах, позволяющее отличить коррозионные вещества (или различные классы коррозионных веществ) или статистические процедуры, используемые для оценки результатов и выявления коррозионных веществ должны быть четко определены и задокументированы. Пороговые значения и статистические процедуры должны быть приемлемыми. Как правило, данные пороговые значения устанавливаются во время оптимизации, проверяются на стадии превалидации и подтверждаются в валидационном исследовании. Например, прогнозирование разъедающего/коррозионного потенциала на модели EpiDerm™ [10].

Исследуемое вещество признается коррозионным для кожи, если:

- жизнеспособность после 3 мин воздействия составляет менее 50% или

- жизнеспособность после 3 мин воздействия больше или равна 50% и жизнеспособность после 1 ч воздействия составляет менее 15%.

Исследуемое вещество признается некоррозионным для кожи, если:

- жизнеспособность после 3 мин воздействия больше или равна 50% и жизнеспособность после 1 ч воздействия больше или равна 15%.

     6 Данные и отчет о проведении испытания

6.1 Данные