ГОСТ 32638-2014

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro

Methods of testing the chemicals of human hazard. In vitro mammalian cell gene mutation test

МКС 13.020.01

Дата введения 2015-06-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ" (ФГУП "ВНИЦСМВ"), Техническим комитетом по стандартизации ТК 339 "Безопасность сырья, материалов и веществ" на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2014 г. N 67-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 сентября 2014 г. N 1232-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32638-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2015 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD, Test No. 476:1997* "Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro" ("In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test", IDT).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Май 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro может быть использован для анализа генных мутаций, индуцируемых химическими соединениями. Наиболее часто используются следующие культуры: мышиная лимфома L5178Y, клеточные линии СНО, AS52 и V79 китайского хомячка; лимфобластные клетки человека ТК6 [2]. В этих клеточных линиях для изучения мутаций наиболее часто исследуются генетические маркеры, оценивающие мутации генов тимидин киназы (ТК) и гипоксантин-гуанидин фосфорибозил трансферазы (HPRT) и трансгена ксантин-гуанидин фосфорибозил трасферазы (XPRT). ТК, HPRT и XPRT выявляют различные спектры генетических событий. Аутосомная локализация ТК и XPRT позволяет выявлять генетические события (т.е. большие делеции), не определяемые в HPRT-локусе Х-хромосомы [3], [4], [5], [6], [7].

     1 Область применения

В тесте оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro используются культуры перевиваемых клеточных линий или клеточные штаммы. Клетки отбираются на основе способности роста в культуре и стабильности частоты спонтанных мутаций. Для тестов in vitro обычно требуется использовать экзогенный источник метаболической активации. Система метаболической активации не может полностью воспроизводить условия, присутствующие у млекопитающих in vivo. Следует тщательно избегать условий, которые могут привести к результатам, не отвечающим реальной мутагенности. Позитивные результаты, не отвечающие реальной мутагенности, могут возникать вследствие изменения рН, осмотической концентрации раствора, высокого уровня токсичности [8].

Тест применяется для скрининга потенциальной мутагенности и канцерогенности для млекопитающих. Многие вещества, позитивные в данном тесте, являются канцерогенами для млекопитающих. Однако нет высокой корреляции между результатами данного теста и канцерогенностью. Степень корреляции зависит от класса химических соединений. Возрастает количество данных, показывающих, что имеются канцерогены, которые не выявляются в данном тесте, поскольку они действуют через другие, не генотоксические, механизмы или механизм их действия не выявляется в этих клетках [7].

     2 Термины и определения

2.1 время фенотипической экспрессии (phenotypic expression time): Период времени, в течение которого неизмененные генные продукты заменяются новыми из мутантных клеток.

2.2 выживаемость (survival): Эффективность клонирования обработанных клеток на период окончания воздействия; выживаемость обычно приводят как отношение к выживаемости контрольной популяции клеток.

2.3 жизнеспособность (viability): Эффективность клонирования обработанных клеток во время посева в селективных условиях после периода экспрессии.

2.4 мутагены типа замены пар оснований (base pair substitution mutagens): Вещества, которые вызывают замену одной или нескольких пар оснований в ДНК.

2.5 мутагены типа сдвига рамки считывания генетического кода (фраймшифт мутагены) (frameshift mutagens): Вещества, которые вызывают вставку или делецию одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.

2.6 относительный общий рост (relative total growth): Возрастание числа клеток за определенное время в опытном варианте по сравнению с контрольной популяцией клеток.

2.7 относительный суспензионный рост (relative suspension growth): Возрастание числа клеток за период экспрессии относительно отрицательного контроля.

2.8 прямая мутация (forward mutation): Генная мутация от родительского типа к мутантному типу, которая приводит к изменению или потере активности фермента или функции кодируемого белка.

2.9 частота мутантов (mutant frequency): Отношение числа выявленных мутантных клеток к общему числу выживших клеток.

     3 Принцип исследования

Клетки, дефицитные по тимидинкиназе (ТК) вследствие мутации ТК+ ТК-, резистентны к цитотоксическому эффекту пиримидинового аналога трифтортимидина (ТФТ). Клетки, профицитные по тимидинкиназе, чувствительны к ТФТ, который вызывает ингибицию клеточного метаболизма и останавливает клеточное деление. Только мутантные клетки способны пролиферировать в присутствии ТФТ, в то время как содержащие тимидинкиназу нормальные клетки не пролиферируют. Аналогично клетки, дефицитные по HPRT или XPRT, отбираются по резистентности к 6-тиогуанину (ТГ) или 8-азагуанину (АГ). При тестировании генных мутаций in vitro следует тщательно анализировать особенности исследуемых веществ, не являются ли они аналогами оснований или соединениями, связанными с селективными агентами, используемыми в данной тест-системе. Например, любая ожидаемая селективная токсичность исследуемого соединения должна изучаться для мутантных и немутантных клеток. Приемлемость отбора система/агент должна быть подтверждена, когда исследуемое соединение по химической структуре связано с селективным агентом.

Клеточная суспензия или клеточный монослой подвергаются воздействию исследуемого соединения как в варианте с, так и без метаболической активации в течение адекватного интервала времени и затем субкультивируются для определения цитотоксичности и фенотипической экспрессии до отбора мутантов [10], [11], [12], [13], [14]. Цитотоксичность обычно оценивается по соотношению эффективности клонирования (выживаемости) или по соотношению общего роста культур после воздействия. Обработанные культуры содержат в культуральной среде необходимый период времени, характерный для каждого селективного локуса и клеточного типа, чтобы проявилась близкая к оптимальной фенотипическая экспрессия индуцированных мутаций. Частота мутаций определяется путем посева определенного числа клеток в содержащую селективный агент культуральную среду для выявления мутантных клеток и в среду без селективного агента для определения эффективности клонирования (выживаемости). После соответствующего времени инкубации подсчитывают колонии. Частота мутаций определяется из числа колоний в селективной среде и числа колоний в неселективной среде.

     4 Описание метода

     4.1 Материалы

     4.1.1 Клетки