МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов

6.1.3. Определение отсутствия (наличия) плазмидного материала

Сущность метода определения плазмидного материала, в т.ч. плазмид, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность, заключается в выделении плазмидного материала и визуализации результатов с использованием электрофореза в агарозном геле для определения наличия плазмидной ДНК и плазмид, кодирующих признаки устойчивости к антибиотикам.

Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы, инструменты, питательные среды, реагенты*

_______________

* Допускается использовать другие аппаратуру, материалы, лабораторную посуду, реактивы, инструменты, питательные среды, реагенты с аналогичными характеристиками, прошедшие регистрацию в РФ в установленном порядке.

Набор реагентов GeneJET для выделения плазмидной ДНК

Наконечники Omnitip до 300 мкл, 1096 запасной блок

Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл

Наконечники Omnitip до 200 мкл, 1096 запасной блок

GeneRuler 100+ п.н. ДНК-маркер

10Х ТВЕ буфер для электрофореза

TopVision LE GQ агароза

Пипетка Research. Объем 0,5-10 мкл

Пипетка Research. Объем 2,0-20 мкл

Пипетка Research. Объем 10-100 мкл

Пипетки Research. Объем 20-200 мкл

Пипетка Research. Объем 100-1000 мкл

Источник питания Эльф-4

Весы Scout Pro, 120 г/0,001 г

Центрифуга/вортекс Микроспин

Камера, 170120 мм

UV-cleaner box

Центрифуга MiniSpin plus

Система регистрации результатов электрофореза Gel Imager

Подготовка к анализу

Исследование должно проводиться в специально оборудованных помещениях, состоящих из комнаты для работы с микроорганизмами, ПЦР-оборудованного помещения для работы с препаратами ДНК и комнаты для постановки электрофореза и учета результатов. Не допускается проведение микробиологических этапов исследования, выделения ДНК и анализа присутствия плазмидной ДНК в образцах в помещениях, не предназначенных для этих целей, во избежание контаминации и неверной интерпретации результатов.

Методика выделения плазмидной ДНК обеспечивает получение низкоразмерной ДНК с высокой степенью чистоты из культур клеток-бактерий. Для анализа используется набор типа К0503, основной составной частью которого является микроколонка, протекание жидкости через неё обеспечивается центрифугированием. Колонка содержит специальную мембрану на силикатной основе. Набор позволяет получить до 20 мкг высококопийной плазмидной ДНК за одно выделение. Оптимальный объем клеточной культуры, используемой на начальном этапе, и реальное количество выделяемой ДНК зависит от среды, применяемой для роста клеточной культуры, и количества копий плазмиды.

Проведение анализа: