МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов

6.1.2. Определения отсутствия трансмиссивных генов антибиотикорезистентности

6.1.2.1. Отсутствие у штамма генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность, дополнительно к фенотипическому профилю антибиотикорезистентности (в случае необходимости), устанавливается в соответствии с методикой, включенной в МУК 4.2.2305-07 "Определение генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией". Тестирование наличия последовательностей ДНК, кодирующих трансмиссивную устойчивость к медицинским и ветеринарным антибиотикам - ermС (к эритромицину, плазмиды рЕ194 Staphylococcus aureus), tetO (к тетрациклину, хромосомы Streptococcus pneumoniae), amp (к ампициллину, плазмиды pBR322 Esherichia coli), hph (к гигромицину, хромосомы Streptomyces hygroscopicus), sh blе (к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus) проводится многокомпонентным набором праймеров производства НИИЭМ им. Гамалеи РАМН "ГМ-БАКТ-1" по ТУ 9398-001-01897357-08 по инструкции, прилагаемой к тест-системе.

Допускается для определения генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность у бифидобактерий, использовать праймеры согласно табл.4.

Таблица 4

     
Праймеры для ПЦР-анализа бифидобактерий на наличие генов устойчивости к антибиотикам

6.1.2.2. Гены, кодирующие трансмиссивную антибиотикорезистентность, могут также быть выявлены методом определения нуклеотидной последовательности ДНК штамма (секвенирование).

Нуклеотидную последовательность ДНК определяют по методу Sanger. Реакцию проводят по протоколу фирмы "Promega" в 3 стадии:

1. Радиомаркирование (кинирование) праймера.

Реакция кинирования праймера проходит в объеме 10 мкл в следующих условиях: 50 мМ Tris- HCl pН 7,5; 10 мМ ; 5 мМ DTT; 0,1 мМ спермидина; 10 pmol праймера; 10 рМ []dATP; 5 ед. Т4-полинуклеотид киназы. Инкубировать 30 мин на 37 °С, затем активность фермента T4-Kinase останавливают повышением температуры до 90 °С в течение 2 мин.

2. Синтез меченых цепей методом ПЦР.

Кинированный праймер используется для синтеза методом ПЦР меченых цепей ДНК разной длины, терминированных случайным включением ddNTP. Реакция проводится в 17,5 мкл в условиях: 50 мМ , рН 9,0; 10 мМ ; 1, 5 pmol кинированного праймера; 40 fmol матричной ДНК; 5 ед. Tag-полимеразы. В заранее подготовленные 4 пробирки, содержащие ddNTP, 50 мМ , раскапывают по 4 мкл реакционной смеси, сверху наслаивают вазелиновое масло и проводят амплификацию. Реакция проходит в следующих условиях: плавление цепей - 95 °С - 0,5 мин; отжиг затравок - 42 °С - 0,5 мин; элонгация цепей ДНК - 70 °С - 1 мин. Продолжительность амплификации составляет 30 циклов. Останавливают реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95% формамида, 20 мМ ЭДТА; 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксиленцианола FF).

3. Электрофорез.

Полученные образцы прогревают 2 мин при 70 °С и наносят на 6%-ный полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слот геля наносят по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводят при постоянном напряжении (25-30 V/cm) при температуре 55 °С. По окончании электрофореза проводят фиксирование геля в 10%-ной уксусной кислоте, затем гель сушат 30 мин на стекле при температуре 60 °С. Экспонирование с рентгеновской пленкой "Кодак" проводят в течение 15-48 ч при комнатной температуре.

Секвенирование генома испытуемого штамма сопоставляют с базой данных для референс-штаммов вида, используемых в пищевых продуктах, для выявления генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность.