МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов

6.1.1. Определение фенотипического профиля чувствительности/резистентности штамма к антимикробным препаратам

Чувствительность/резистентность штаммов к антимикробным препаратам определяют диско-диффузионным методом (ДДМ) с наложением стандартных бумажных дисков, пропитанных антимикробными препаратами, на поверхность плотной среды и/или методом серийного разведения антибиотика в жидкой питательной среде. Метод основан на способности антимикробных препаратов, диффундирующих в питательную среду, угнетать рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара, вокруг дисков с образованием зон задержки роста, или подавлять рост микробов в жидкой среде с внесенными в неё различными концентрациями препаратов. В этом случае для характеристики чувствительности штаммов к антимикробным препаратам устанавливают минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), при которой отсутствует видимый рост культуры. Эта концентрация определяет степень чувствительности штамма к антибиотику.

Для оценки следует использовать не менее 25-30 наименований из числа основных употребляемых в медицине групп антимикробных препаратов (пенициллины, цефалоспорины 1 и 3 поколений, карбапинемы, аминогликозиды 1, 2, 3 поколений, тетрациклины, макролиды, линкозамины, гликопептиды, полимиксины, хинолоны и фторхинолоны).

А. Тестирование бифидобактерий диско-диффузионным методом

Используют модифицированный в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Габричевского" диско-диффузионный метод на основе МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам" и рекомендаций Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов, NCCL" 2002 г., США. Используют диски с антибиотиками производства НИИЭМ им.Пастера (Россия, Санкт-Петербург).

Бактериальную культуру готовят общепринятым методом из лиофилизированного материала. Третью генерацию бульонной культуры из разведения 10 в количестве 0,1 мл наносят на поверхность агаризованной БС-среды для культивирования и выделения бифидобактерий производства НИИ прикладной микробиологии, г.Оболенск, разлитой в чашки Петри слоем не меньше 4-5 мм непосредственно перед постановкой опыта. Круговыми движениями шпателя быстро равномерно втирают материал в агаризованную среду, раскладывают антибиотики по трафарету (не более 5 дисков с антибиотиками на чашку), с учетом зон задержки роста культур для каждого из антибиотиков (зоны оценивали в предварительном эксперименте). Чашки помещают в анаэростаты с атмосферой, содержащей 10% , генерируемой газпаками фирмы Биомерье. Учет зон задержки роста бактериальной культуры проводят через 24 ч выращивания при (37,5±1) °С.

Интерпретацию полученных результатов проводят при использовании пограничных значений чувствительности бифидобактерий, разделяющих их на три категории, установленных в табл.2.

Таблица 2

Критерии интерпретации результатов для оценки чувствительности бифидобактерий [по Жиленковой О.Г., Амерхановой А.М., 2009; Назыровой Н.Р., 2008]

Б. Тестирование лактобактерий диско-диффузионным методом

Используют агаризованную питательную среду МРС, которую вносят в чашки диаметром 90 мм в объеме 20 мл для достижения слоя агара (4,0±0,5) мм.

Из тестируемых культур готовят суспензии, соответствующие по плотности оптическому стандарту мутности на 5 единиц (с содержанием микробных тел около 1,5-510 КОЕ/мл), которые наносят на поверхность агара по стандартной методике.

Диски с антимикробными препаратами наносят по 5 штук на поверхность агара через 15 мин после его инокуляции взвесью испытуемого штамма.

Инокулированные чашки с дисками инкубируют при температуре 35 °С в течение 18-24 ч, после чего измеряют диаметры зон задержки роста кронциркулем с точностью до 1 мм. Исследование осуществляют в трехкратной повторности, результаты выражают в виде средней арифметической.

Критерии интерпретации результатов для оценки чувствительности лактобактерий (пограничные значения зон торможения роста) приведены в табл.3.

Таблица 3

     
Критерии интерпретации результатов для оценки чувствительности лактобактернй по [Назыровой Н.Р. с соавт., 2008]

В. Тестирование чувствительности бифидобактерий и лактобактерий методом серийных разведений.

Тестирование проводится в соответствии с методическим указаниями МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

Постановка метода серийных разведений для оценки антибиотико-резистентности включает следующие этапы: