МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов

5.3.2. Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности лактобактерий

5.3.2.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК для идентификации видовой принадлежности Lactobacillus spp.

Сущность метода. Секвенированием ДНК называют комплекс методов, позволяющих определить нуклеотидную последовательность ДНК или ее фрагментов. Для идентификации и классификации бактерий определяют нуклеотидную последовательность наиболее консервативных участков бактериального генома. Изучение полных нуклеотидных последовательностей отдельных генов дает дополнительную информацию об эволюции таксона. Родственные представители обычно обладают гомологичными по последовательности генами. Поэтому на данный момент таксономия базируется в основном на данных секвенирования малой субъединицы рРНК, как наиболее информационном виде анализа (Ботина и др., 2005, 2007).

5.3.2.2. Оборудование, материалы, лабораторная посуда, реактивы.

А. Реактивы:

50мМ Трис-HCl

10мМ ЭДТА-Na

хлороформ

лизоцим

РНКаза

10% SDS

5М NaCl

фенол

изопропанол

деионизированная вода

Tag-полимераза

праймеры (фирма "Синтол")

агароза

Б. Оборудование:

термостатный бокс для выращивания микроорганизмов

центрифуга

центрифуга вортекс

водяная баня

амплификатор Отn-Е фирмы Hybaid

камера для электрофореза.

5.3.2.3. Выделение ДНК

Выращивание всех штаммов лактобактерий проводят в жидкой стандартной среде МРС при 37 °С в течение 24-48 ч.

Клетки из 14 мл культуры осаждают центрифугированием при 4400 g в течение 12 мин и ресуспендируют в 7 мл буфера 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА-Na, pH 8,0. Суспензию клеток центрифугируют в тех же условиях и осадок ресуспендируют в 500 мкл указанного выше буфера; суспензию переносят в 2-мл центрифужную пробирку и добавляют 50 мкл хлороформа. Смесь энергично встряхивают с помощью вортекса (5 раз по 10 сек), вносят 100 мкл лизоцима (60 мг/мл) и инкубируют 30 мин при 37 °С; затем добавляют 6 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин при 37 °С. Для лизиса клеток суспензию мягко смешивают с 200 мкл 10% ДСН (SDS) и 200 мкл 5 М NaCl; смесь инкубируют 16 ч при 65 °С. Полученный грубый лизат клеток остужают до комнатной температуры, добавляют 1 мл смеси фенол/хлороформ (1:1) и тщательно смешивают в течение 5 мин до состояния гомогенной эмульсии; смесь центрифугируют при 12000 g 15 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, отбирают в новую 1,5-мл пробирку и смешивают с 600 мкл изопропанола. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 12000 g 20 мин. Осадок ДНК трижды промывают порциями по 0,5 мл 75%-ного этанола (центрифугирование по 5 мин при 12000 g) и растворяют в 100 мкл деионизованной воды. ДНК хранят при -20 °С.

5.3.2.4. Анализ рибосомной нуклеиновой кислоты.