На данном этапе идентификации определяются основные фенотипические признаки чистой культуры штамма: культуральные свойства колоний, морфология клеток в микроскопических препаратах (в живом и зафиксированном виде), отношение к окраске по Граму, способность к спорообразованию, а также каталазная и нитратредуцирующая активность при использовании общепринятых в микробиологии методов анализа.
Чистую культуру штамма выделяют на рекомендованной для данного вида микроорганизмов питательной среде, позволяющей получать изолированные колонии. Например, выделение чистой культуры лактобактерий должно осуществляться со среды MRS, термофильных стрептококков - со среды типа М17 по ГОСТ Р 51331-99, бифидобактерий - со среды Блаурокка, среды для бифидобактерий (г.Оболенск) или тиогликолевой среды.
Потенциальные пробиотические штаммы должны обладать типичными для рода культуральными признаками на всех типах сред (твердых, полужидких и жидких) без признаков диссоциации, а также однородными морфологическими, тинкториальными свойствами, окрашиваться по Граму положительно, не иметь спор и капсул, не восстанавливать нитраты, не продуцировать каталазу.