Р 4.2.2643-10 Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности

5.1. Методы изучения и оценки бактерицидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций

5.1.1. Тест-микроорганизмы для изучения бактерицидной активности ДС и их субстанций. Требования к тест-микроорганизмам

При изучении бактерицидной активности дезинфицирующих субстанций и ДС в качестве тест-микроорганизмов используют [66]: Escherichia coli (штамм 1257), Pseudomonas aeruginosa (штамм АТСС 27853), Salmonella typhimurium - для оценки бактерицидной активности в отношении грамотрицательных бактерий; Staphylococcus aureus (штамм 906) - для оценки бактерицидной активности в отношении грамположительных бактерий.

При сертификационных испытаниях и экспертной оценке ранее зарегистрированных ДС набор тест-микроорганизмов может быть ограничен наиболее устойчивыми представителями каждой группы.

Перечень тест-микроорганизмов, если он шире стандартного, указан в соответствующих разделах по изучению эффективности ДС при обеззараживании отдельных объектов.

Условия культивирования тест-микроорганизмов. Тест-микроорганизмы - Е. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa и S. aureus - культивируют на следующих питательных средах: казеиновом бульоне, мясо-пептонном бульоне, агаре Эндо, казеиновом агаре, мясо-пептонном агаре и т.п. при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.

Музейные культуры указанных выше микроорганизмов хранят при температуре плюс (3±1) °С в ампулах (после лиофильной сушки) или на плотных питательных средах (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5-3 мм), а рабочие культуры - на скошенном агаре или в бульоне.

Тест-микроорганизмы должны иметь типичные биохимические, морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства, присущие данному виду [66], и обладать стандартной устойчивостью к эталонным дезинфицирующим средствам: растворам хлорамина, перекиси водорода, Катамина АБ - алкилдиметилбензиламмония хлорида АДБАХg, глутарового альдегида (табл.5.1).

Таблица 5.1

Устойчивость тест-микроорганизмов к дезинфицирующим агентам

Устойчивость тест-микроорганизмов к эталонным дезинфицирующим средствам определяют методом батистовых тест-объектов (п.5.1.2.2).

Проверку устойчивости тест-микроорганизмов проводят не реже 1 раза в месяц. При снижении резистентности культур делают их пересевы на обогащенные питательные среды до восстановления устойчивости.

5.1.1.1. Методы приготовления суспензии тест-микроорганизмов.

Определение биологической концентрации тест-микроорганизмов в бактериальной суспензии

Культуры тест-микроорганизмов подвергают контролю их качества. В частности, непосредственно перед использованием тест-культур для исследовательских целей необходимо убедиться в том, что тест-штаммы, выросшие на питательной среде, не загрязнены посторонней микрофлорой. Для оценки роста культур тест-штаммов визуально просматривают каждую пробирку и учитывают характер и массивность роста, изменение цвета питательной среды. Проводят микроскопию мазка выросших культур, окрашенных по Грамму.

Рабочую суспензию тест-культур готовят из культуры данного тест-штамма, выращенного на плотной питательной среде (МПА или казеиновый агар) при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Для приготовления бактериальной взвеси культуру смывают с агара стерильной питьевой водой. Полученную взвесь микробов фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разводят стерильной питьевой водой до концентрации, соответствующей по мутности оптическому стандарту мутности (ФГУН "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича" Роспотребнадзора) N 20 (он соответствует 2·10 микробных тел в 1 мл).

В связи с тем что суспензия может содержать наряду с живыми мертвые микроорганизмы, необходимо определять бактериологическую концентрацию фактического количества живых клеток в приготовленной суспензии, чтобы при необходимости внести коррективы и обеспечить требуемые уровни контаминации батистовых тест-объектов жизнеспособными микроорганизмами.

Определение биологической концентрации тест-микроорганизмов выполняют методом последовательных десятикратных разведений суспензии тест-микроорганизма в стерильной питьевой воде с последующим высевом суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (казеиновый агар, агар Эндо, МПА). После определенного времени инкубации при соответствующей температуре проводят подсчет выросших колониеобразующих единиц КОЕ и определяют количество жизнеспособных бактерий в одном мл суспензии.

Из практики известно, что суспензия, содержащая такое количество живых микробов, при контаминации ею батистовых тест-объектов обеспечивает требуемые (порядка 1·10-1·10 КОЕ/см) уровни их обсеменения живыми клетками тест-микроба.

5.1.1.2. Приготовление рабочих растворов ДС и их субстанций

Рабочие растворы ДС и их субстанций готовят непосредственно перед проведением исследований (кроме тех случаев, когда изучают стабильность рабочих растворов в процессе хранения).

При изучении средств, производимых в форме гранул, порошков, таблеток и т.п., рабочие растворы используют только после полного растворения ДВ дезинфицирующего средства (если не указано на возможность выпадения осадка).

Для оценки антимикробного действия субстанций и ДС в лабораторных условиях и исследования эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания различных объектов, растворы готовят на стерильной питьевой воде. Для этого необходимое количество сухого ДС или жидкого концентрата вносят в пробирку (колбу) и добавляют расчетное количество воды, тщательно размешивают и закрывают пробкой. Отмечают время полного растворения и внешний вид приготовленного рабочего раствора.

Температура растворов ДС должна быть в пределах плюс (20±2) °С (если по условиям эксперимента не рекомендована другая температура) независимо от температуры окружающей среды. Для поддержания требуемой температуры используют водяную баню.

При испытании ДС в практических условиях рабочие растворы готовят на нестерильной питьевой воде комнатной температуры (20±2) °С или при необходимости - умеренно повышенной температуры 45-50 °С. Навеску средства или отмеренное количество жидкого концентрата вносят в соответствующую емкость, добавляют воду, размешивают и закрывают крышкой. Работу с раствором начинают после полного растворения ДВ. Рабочие растворы из ДС в форме таблеток готовят путем добавления в отмеренный объем воды определенного числа таблеток.

Рабочие растворы субстанций и ДС готовят с соблюдением мер предосторожности. Если ДВ относится к летучим веществам и представляет опасность при ингаляционном воздействии, растворы готовят в вытяжном шкафу или в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией, в респираторе РУ 60М или РПГ-67, кожу рук защищают резиновыми перчатками, глаза - защитными очками.

Исследуемые ДС (перед, во время и после исследований) следует хранить в соответствии с требованиями технических условий или спецификации; при отсутствии таковых - в соответствии с СП 3.5.1378-03 [14].

5.1.2. Методы исследований и оценки результатов бактерицидной активности ДС и их субстанций in vitro