МР 01.015-07

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ САКСИТОКСИНА В МОЛЛЮСКАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ "RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)", производства фирмы R-Biopharm AG, Германия

1. Методические рекомендации разработаны:

ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А.Тутельян, д.м.н., профессор С.А.Хотимченко, Ю.А.Коханова), Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (И.В.Брагина, Е.С.Шальнова, Л.С.Осипова), ООО "Стайлаб" (А.В.Галкин).

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28 мая 2007 г.)

3. Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.

4. Введены впервые.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-определения содержания сакситоксина в моллюсках методом иммуноферментного анализа.

Диапазон определяемых концентраций составляет 50-800 мкг/кг.

2. Общие положения

Фикотоксины представляют собой группу веществ, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микроводорослей и цианобактерий. Эти вещества способны аккумулироваться в организме морских и пресноводных животных и, при попадании в организм человека, вызывать отравления различной степени тяжести.

Токсины, входящие в группу PSP (paralytic shellfish poison) (паралитический яд моллюсков), являются одними из сильнейших нервно-паралитических ядов, известных человечеству. Свое название они получили по синдрому вызываемого ими отравления. Существует более 24 форм PSP, обладающих способностью к взаимопревращению в метаболических реакциях. Сакситоксин является наиболее токсичным представителем данной группы веществ.

Отравления людей токсинами группы PSP происходят ежегодно. Основными продуктами, употребление которых приводит к интоксикации, являются двустворчатые моллюски. Установлено, что тепловая обработка или замораживание не позволяют полностью освободить продукты от PSP. Около 15% всех зарегистрированных случаев отравления приводят к летальному исходу.

Механизм действия сакситоксина и его производных заключается в блокировании токсином тока ионов натрия через потенциал-зависимые натриевые каналы в мембранах нервных и мышечных клеток, что ведет к нарушению клеточной деполяризации и, как следствие, нарушению проводимости.

Проявления отравления PSP варьируются от чувства онемения и легкого покалывания в области губ до летального исхода. В среднетяжелых и тяжелых случаях к этим ощущениям присоединяется онемение кончиков пальцев кистей рук и стоп, которое в течение 4-6 часов распространяется на руки, ноги и шею. Резко затруднены движения. Нарушаются функции черепно-мозговых нервов. Реже встречаются гастроинтестинальные симптомы, которые проявляются в виде тошноты, рвоты, диареи и болей в животе. Сознание пострадавших остается ясным.

В случае летального исхода смерть наступает в результате развития дыхательной недостаточности в течение 2-12 часов с момента отравления.

Антидота для токсинов PSP на данный момент не существует.

Безопасный уровень содержания PSP в тканях моллюсков был установлен FDA (Food and Drug Administration) и составляет 80 микрограмм/100 грамм продукта.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы "RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)" представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения сакситоксина и некоторых его производных в моллюсках.

3. Принцип метода

Принцип работы тест-системы "RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)" основан на методе конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами "захвата", специфичными к антителам к сакситоксину.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к сакситоксину и препарат, содержащий конъюгат сакситоксина с ферментом, дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы сакситоксина и молекулы конъюгата сакситоксина с ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к сакситоксину. В то же самое время, при инкубации, происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами "захвата" на поверхности.

Далее, путем промывки планшета, из лунок удаляются свободные молекулы конъюгата.

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации сакситоксина в исследуемых образцах.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений концентрации сакситоксина применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

4.1 Средства измерений

4.2 Реактивы

Тест-система "RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)" для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая: