МР 01.016-07

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКАДАИКОВОЙ КИСЛОТЫ В МОЛЛЮСКАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ "DSP-Check", производства фирмы Parapharm Laboratories Co., Ltd, Япония

1. Методические рекомендации разработаны:

ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А.Тутельян, д.м.н., профессор С.А.Хотимченко, Ю.А.Коханова), Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (И.В.Брагина, Е.С.Шальнова, Л.С.Осипова), ООО "Стайлаб" (А.В.Галкин).

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28 мая 2007 г.)

3. Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.

4. Введены впервые.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-определения содержания окадаиковой кислоты в моллюсках методом иммуноферментного анализа.

Диапазон определяемых концентраций составляет 100-1000 мкг/кг.

2. Общие положения

Фикотоксины представляют собой группу веществ, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микроводорослей и цианобактерий. Эти вещества способны аккумулироваться в организме морских и пресноводных животных и, при попадании в организм человека, вызывать отравления различной степени тяжести.

Фикотоксины, входящие в группу DSP (diarrhoeic shellfish poison - диарейный яд моллюсков), получили свое название по синдрому вызываемого ими отравления. К данной группе относятся окадаиковая кислота и ее производные - динофизистоксины.

Синдром отравления DSP-токсинами широко распространен. Особо часто сезонные вспышки происходят в Европе и Японии, однако случаи отравления DSP отмечаются и в Америке, Южной Африке, Новой Зеландии, Австралии и Таиланде. В ряде стран DSP токсины нередко обнаруживаются в моллюсках при исследованиях, проводимых в рамках программ мониторинга.

Основной механизм действия окадаиковой кислоты заключается в ингибировании серин/треонин фосфатазы 1 и 2А и опосредованном потенцировании действия серин-треонин киназ. Это приводит к избыточному накоплению фосфорилированных белков и нарушению многих процессор, протекающих в клетке. Кроме того, окадаиковая кислота является мощным стимулятором развития опухолевых процессов.

Основными симптомами при отравлении окадаиковой кислотой являются диарея, тошнота, рвота, боли в животе. Они развиваются через 30 мин - несколько часов после употребления контаминированных моллюсков. Продолжительность этого периода обычно недолгая - в тяжелых случаях до нескольких дней. Однако при хронической интоксикации возможно развитие опухолевых процессов.

Безопасный уровень содержания DSP токсинов в тканях двустворчатых моллюсков был установлен Европейским Союзом в 2002 году для окадаиковой кислоты, динофизистоксинов и пектенотоксинов в сумме не более 160 мкг/кг эквивалента окадаиковой кислоты.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы "DSP-Check" представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения окадаиковой кислоты в моллюсках.

3. Принцип метода

Принцип работы тест-системы "DSP-Check" основан на методе конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован окадаиковой кислотой.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые (стандартные) образцы, препарат, содержащий антитела к окадаиковой кислоте, конъюгированные с ферментом, дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы окадаиковой кислоты в объеме раствора и на поверхности планшета, конкурируя между собой, взаимодействуют с конъюгированными антителами к окадаиковой кислоте. В процессе конкуренции происходит иммуносорбция антител к окадаиковой кислоте на поверхности планшета, степень которой обратно пропорциональна концентрации токсина в объеме раствора.

Далее, путем промывки планшета, из лунок удаляются несвязанные конъюгированные антитела к окадаиковой кислоте.

После промывки планшета в его лунки дозируется смесь субстрата с хромогеном. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации окадаиковой кислоты в исследуемых образцах.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений концентрации окадаиковой кислоты применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

4.1 Средства измерений

4.2 Реактивы

Тест-система "DSP-Check" для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая: