МУК 4.2.2413-08 Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

5. Порядок проведения исследования

Все работы по проведению исследования материала подозрительного на наличие возбудителя сибирской язвы проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

Схема проведения анализа представлена на рис.9 (прилож.7).

Исследования на сибирскую язву можно разделить на два этапа:

1) обнаружение возбудителя или его компонентов (ДНК, антигенов) в организме больных людей, животных, секционном материале или объектах окружающей среды, с которыми имели контакт заболевшие и которые могли быть источником инфицирования;

2) выделение и идентификация чистой культуры возбудителя с последующим изучением ее свойств.

При исследовании патологического материала от людей и животных готовят мазки из нативных проб, окрашивают их по Граму и люминесцирующими иммуноглобулинами, засевают на плотные и жидкие питательные среды, заражают лабораторных животных и проводят ПЦР-анализ.

При исследовании методом ПЦР материала, в котором предполагается наличие возбудителя сибирской язвы в виде спор, проводится их предварительная герминация с целью последующего обеззараживания и выделения ДНК.

Для анализа проб кожи, шкуры и шерсти к уже указанным методам добавляется реакция преципитации и исключается бактериоскопия и МФА.

Подготовленные для исследования пробы делятся на две части, одну из которых прогревают при 80 °С в течение 20 мин. Из непрогретой и прогретой частей материала проводят высев на плотные и жидкие питательные среды, заражают биопробных животных и проводят ПЦР-анализ. Исследование образцов из объектов окружающей среды осуществляют аналогично без использования реакции преципитации.

Загнивший патологический материал исследуют с помощью реакции преципитации и ПЦР.

В лечебных учреждениях, куда поступает больной с подозрением на сибирскую язву, производится забор материала, который направляется в лаборатории особо опасных инфекций Центров гигиены и эпидемиологии, в противочумные учреждения. В лечебных учреждениях больным с подозрением на сибирскую язву также производят постановку кожной аллергической пробы с антраксином.

В лабораториях особо опасных инфекций Центров гигиены и эпидемиологии, в противочумных учреждениях проводят специфическую индикацию, выделение культур и их идентификацию основными методами, используя при наличии возможностей дополнительные методы. Материал от животных (трупов) исследуют всеми методами в ветеринарных лабораториях, специализированных центрах и ветеринарных НИИ.

Выделенные в лабораториях учреждений Федеральной службы культуры В. anthracis после идентификации, вместе с паспортами направляют в вышестоящие учреждения в соответствии с установленным действующими документами порядком.

Культуры, выделенные в учреждениях ветеринарного профиля, направляются для окончательной идентификации во Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (г.Покров).

Алгоритмы действий получателей материала, в котором предполагается наличие порошка, содержащего споры возбудителя сибирской язвы и других патогенных биологических агентов (подозрительных почтовых отправлений), а также специалистов, участвующих в проведении противоэпидемических мероприятий и лабораторных исследований, определены методическими рекомендациями МР 0100/0556-04-34 "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ".

5.1. Бактериоскопия

5.1.1. Световая микроскопия

Из поступившего патологического материала (от людей и животных) готовят несколько мазков, которые подсушивают на воздухе, фиксируют в спирте с добавлением 3% перекиси водорода не более 30 мин (прилож.2.1.), после этого окрашивают по Граму и на капсулу одним из методов (по Ребигеру, Михину, Романовскому-Гимза). В окрашенных мазках из патологического материала сибиреязвенный микроб представляет собой грамположительные палочки, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях (чаще в мазках от человека или свиней) форма возбудителя сибирской язвы может быть нехарактерной (короткие, толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки с вздутием посередине или на конце, возможно наличие "теней" микробов).

Для обнаружения капсул лучшей краской является раствор Ребигера (прилож.2.2). На всю поверхность фиксированного мазка пипеткой наносят раствор Ребигера и выдерживают 30-60 сек, затем промывают водой и высушивают. В мазках из свежего патологического материала капсула вокруг микроба окрашивается в розовый или красно-фиолетовый цвет, тело микробной клетки - в темно-фиолетовый. В мазках из крови и спинномозговой жидкости палочки с капсулой увеличены, края микроба закруглены.

При окраске мазков из несвежего патологического материала микробы могут быть также несколько увеличены, концы закруглены, морфологическая стройность бацилл нарушена, они как бы "изъедены", иногда остаются "тени", а от капсулы могут оставаться одни обрывки, которые окрашиваются очень слабо.

Для обнаружения спор в некоторых образцах внешней среды после фиксации мазки окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нильсену (прилож.2.3). После фиксации мазка на стекло кладут полоску фильтровальной бумажки и на нее наливают карболовый фуксин Циля. Мазок с краской подогревают на пламени спиртовки до появления паров (но не до кипения) и краску оставляют на препарате без подогревания еще на 2-3 мин. Бумажку удаляют пинцетом, краску сливают, препарат промывают водой. Затем обесцвечивают 5%-й серной кислотой до желтоватого оттенка (в течение 3-5 с). Тщательно отмывают препарат водой, ополаскивают 5-10 с 96°-м спиртом, а потом - водой. Докрашивают мазок метиленовой синью Леффлера 2-3 мин, смывают водой и просушивают. Препарат просматривают в микроскопе с иммерсионной системой. В мазках наблюдают палочки синего цвета. Споры, в зависимости от степени их жизнеспособности, могут окрашиваться следующим образом: 1) розовые с более интенсивной окраской по периферии - жизнеспособные; 2) равномерно окрашенные в красный цвет - слабо жизнеспособные; 3) синие - не жизнеспособные. По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

5.1.2. Люминесцентная микроскопия - МФА

Для люминесцентной микроскопии делают мазки-отпечатки из экссудата брюшной полости и органов биопробных животных, мазки-отпечатки из отечной жидкости и внутренних органов людей и животных, мазки из подозрительных колоний, выросших из посевов проб на чашках с питательными средами. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин. На высохшие фиксированные мазки наносят в рабочих разведениях, указанных на этикетке, диагностические сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные соматические иммуноглобулины. В исходных пробах могут быть обнаружены сибиреязвенные микробы в вегетативной или споровой форме. Мазки из смывов, суспензий, вытяжек из материалов, подозрительных на высокую контаминацию возбудителем сибирской язвы, обрабатывают диагностическими люминесцирующими адсорбированными антиспоровыми иммуноглобулинами.

В случае приготовления мазков непосредственно из нативного материала их окрашивают для увеличения контрастности смесью диагностических иммуноглобулинов и бычьего альбумина, меченого родамином. Для этого готовят отдельно разведения иммуноглобулинов и альбумина в 2 раза меньшие, чем указано на этикетках, смешивают их в соотношении 1:1 и наносят на мазки. Например, рабочее разведение люминесцирующих антиспоровых иммуноглобулинов (1) составляет 1:16, а альбумина (2) - 1:8. Смесь составляют из разведения (1) 1:8 и (2) 1:4. Дальнейшую обработку окрашенных таким образом мазков проводят аналогично мазкам, окрашенным только люминесцирующими иммуноглобулинами.

Мазки с нанесенными на них люминесцирующими иммуноглобулинами помещают во влажную камеру (чашку Петри или эксикатор с увлажненной 0,9%-м раствором натрия хлорида или дистиллированной водой фильтровальной бумагой или комочком ваты), выдерживают для окрашивания при 37 °С в течение 20 мин. После этого их тщательно промывают два раза по 10 мин в 0,9%-м растворе натрия хлорида, затем в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Препараты покрывают покровными стеклами или просматривают ex tempore без покровных стекол. Мазки микроскопируют в люминесцентном микроскопе с системой подобранных светофильтров и иммерсионным объективом. При этом необходимо пользоваться нефлуоресцирующим иммерсионным маслом. В случае его отсутствия применяют смесь, содержащую 1 часть 0,9%-го раствора натрия хлорида и 9 частей химически чистого глицерина. Споры и вегетативные клетки сибиреязвенного микроба, окрашенные люминесцирующими иммуноглобулинами, дают яркое свечение периферии клеток, имеющих характерную для данного вида морфологию. Такое свечение называется специфическим, в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным неярким свечением всей поверхности клеток. Для учета результатов используется арбитражная система оценки по интенсивности свечения и количеству специфически светящихся клеток:

- 4 - большое количество специфически светящихся клеток, расположенных длинными цепочками (вегетативная форма), очень яркая флуоресценция по периферии споры или вегетативной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки;