МР 2.3.2.2327-08 Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности (с атласом значимых микроорганизмов)

     5.6 Техника проведения посевов

5.6.1 Техника посева аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (посев на чашки Петри)

Посев на чашки Петри проводят, используя твердые (плотные) питательные среды, содержащие 0,8-1,5% агара или 10-15% желатина, которые дают возможность для роста и подсчета отдельных колоний микроорганизмов.

Для посева обычно готовят 3 стерильные чашки Петри и такое же число пробирок с какой-либо плотной питательной средой (в зависимости от поставленной задачи). Затем выбирают те разведения исследуемого материала, которые должны дать десятки, сотни и тысячи колоний соответственно.

На крышках чашек Петри предварительно делают надписи восковым карандашом, маркером или др., отражающие следующую информацию:

- о материале (продукте), из которого сделан посев;

- о соответствующем разведении;

- о дате проведения посева.

Перед началом посева необходимо заранее подготовить соответствующим образом все необходимые материалы (чашки, пробирки, пипетки, спиртовку и т.д.), обработать спиртом рабочую поверхность стола, руки, расположить на рабочем столе наиболее удобным образом материалы. Посев проводят, соблюдая правила стерильности.

После тщательного перемешивания соответствующего разведения стерильной пипеткой берут 1 см материала и вносят в чашку Петри, слегка приоткрывая крышку со стороны спиртовки и выдувая содержимое пипетки. Таким образом проводят посев всех намеченных разведений.

При посеве на чашки Петри посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае пользуются одной пипеткой.

Затем осторожно приподняв (с одного края) крышку чашки Петри, выливают расплавленную и охлажденную до 40 °С питательную среду. Количество питательной среды, вносимой на одну чашку, должно составлять около 10-15 см.

Все операции при использовании для посевов агаровых сред необходимо проводить быстро, без задержек, чтобы избежать преждевременного застывания агара. Начинающим рекомендуется использовать водяную баню для поддержания температуры агаровых сред на уровне 40-45 °С.

Сразу после внесения питательной среды ее смешивают с посевным материалом легким вращательным покачиванием чашки, но так, чтобы не смочить крышку. Затем чашку с посевом ставят для застывания среды на горизонтальную поверхность.

5.6.2 Техника посева аэробных микроорганизмов

Посев аэробных микроорганизмов проводят на поверхности плотных (твердых) питательных сред, обеспечивая тем самым аэробные условия для их развития.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри и ставят для застывания на горизонтальную поверхность. Застывшую среду подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует слиянию колоний. Подсушивать среду в чашках Петри рекомендуется в термостате при температуре 37-45° С, расположив открытые чашки на стерильной бумаге в перевернутом виде. Время подсушивания - 1 ч. Можно проводить подсушивание в боксе на столе при включенных бактерицидных лампах.

5.6.2.1 Для количественной оценки аэробной микрофлоры исследуемых объектов в подготовленную чашку Петри на поверхность плотной питательной среды вносят 0,1-0,2 см исследуемого материала (объем зависит от конкретных условий) и стерильным шпателем Дригальского втирают посевной материал в питательную среду равномерно по всей поверхности.

5.6.2.2 Для оценки видовой (групповой) принадлежности микрофлоры, содержащейся в материале, поверхностный посев проводят с использованием бактериологической петли. При этом материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно и по линиям, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микроорганизмов.

5.6.3 Техника посева анаэробных микроорганизмов

Для создания условий развития анаэробных микроорганизмов могут быть использованы следующие приемы:

- посев в высокий столбик питательной среды;

- культивирование посевов в анаэростатах или других устройствах, создающих анаэробные условия;

- применение специальных реагентов для создания анаэробных условий.

Посев анаэробных микроорганизмов проводят в пробирках с простерилизованной питательной средой, разлитой высоким столбиком. Для анализа анаэробных микроорганизмов, как правило, используют твердые или полутвердые питательные среды.

Непосредственно перед посевом для снижения содержания свободного кислорода питательные среды, разлитые по пробиркам и закрытые ватными пробками, кипятят в водяной бане в течение 10-20 мин. При кипячении из среды вытесняются газообразные вещества, в том числе кислород.

Пробирки с прокипяченными питательными средами быстро охлаждают до 40 °С и используют для посева.

Засев среды проводят соответствующим разведением посевного материала пипеткой. Посевной материал при этом должен свободно стекать из пипетки без принудительного выдувания.

Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды можно сверху заливать стерильным вазелиновым или парафиновым маслом или водным агаром (толщина слоя 1-1,5 см).