ГОСТ Р 53360-2009 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы

     4 Метод определения ферментативной активности фитазы с образованием молибденовой сини

4.1 Характеристика метода

4.1.1 Метод основан на количественном определении содержания неорганических фосфатов (РО), образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат - фитат натрия (натриевую соль фитиновой кислоты) при определенных стандартных условиях, путем их связывания молибдатом натрия и восстановлением двухлористым оловом с образованием окрашенного в синий цвет комплекса - молибденовой сини.

Метод используется при возникновении разногласий в качестве арбитражного.

4.1.2 За единицу фитазной активности (1 ед. ФА) принимают количество фермента, катализирующее гидролиз фитата натрия с образованием 1 мкмоля неорганического фосфата за одну минуту в стандартных условиях (температура 37 °С, значение рН 5,5, продолжительность гидролиза 15 мин).

4.1.3 Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрическим методом при длине волны от 650 до 700 нм.

4.1.4 Количество выделенных неорганических фосфатов определяют по градуировочному графику, построенному как функция оптической плотности от молярной концентрации фосфатов, мкмоль/см.

Метод позволяет определять от 0,05 до 0,40 мкмоль/см фосфатов. Диапазон измерений контролируемого показателя 500-8000 ед. ФА.

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

4.2.1 Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие средства измерений и оборудование:

- фотоэлектроколориметр (ФЭК) любого типа, который обеспечивает измерения при длине волны от 650 до 700 нм, с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1% (не более 0,01 единицы оптической плотности);

- рН-метр с набором электродов для измерения в диапазоне от 0 до 14 рН, с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,1 рН;

- магнитную мешалку любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин;

- ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры ±1 °С;

- лабораторную центрифугу любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 мин;

- весы лабораторные по ГОСТ 24104, высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, ценой поверочного деления 0,1 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,15 мг; с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, ценой поверочного деления 20 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±30 мг;

- водяную баню любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100±1) °С;

- таймер любого типа с погрешностью ±30 с;

- шкаф сушильный, обеспечивающий температуру нагрева (120±5) °С;

- вытяжной шкаф любого типа;

- механическую мельницу, обеспечивающую размалывание исследуемого образца ферментного препарата до полного прохода пробы через сито;

- сито с размером отверстий 1,0 мм, сделанное из металлического проволочного тканого материала.

4.2.2 Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие лабораторную посуду и материалы:

- колбы мерные 1(2)-50, 100, 200, 500, 1000-2 по ГОСТ 1770;

- воронки ВФ - 1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ 25336;

- пробирки П 1-14-120 ХС или П 1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;

- пипетки по ГОСТ 29227;

- пипетки автоматические с емкостью от 0,1 до 1,0 см с наконечниками;