МУК 4.2.2429-08
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах
Дата введения 2008-12-15
1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина); ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (А.Л.Гинцбург, Ф.С.Флуер).
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.
4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 15 декабря 2008 г.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
ВНЕСЕНЫ Дополнения и изменения N 1, утвержденные и введенные в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации c 26.06.2011
Дополнения и изменения N 1 внесены изготовителем базы данных по тексту М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 год
1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод качественного определения стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, мясе и мясопродуктах; птице и птицепродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа.
1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.
1.3. Методы предназначены для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора и контроля, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.
1.4. Согласно настоящим методическим указаниям предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов соответствует диапазону массовых концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/кг (в зависимости от типа токсина и вида продукта), что ниже уровня 100-200 нг наиболее распространенного из числа известных иммунологических типов стафилококкового энтеротоксина типа А, обусловливающего развитие стафилотоксикоза у человека.
1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг.
(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).
СЭТ - стафилококковые энтеротоксины.
СЭА - стафилококковый энтеротоксин типа А.
СЭВ - стафилококковый энтеротоксин типа В.
ИФА - иммуноферментный анализ.
ИГ, IgG - иммуноглобулины.
Кг - конъюгат.
ОП - оптическая плотность.
Стандартный образец состава - стандартный образец, воспроизводящий значения величин, характеризующих содержание определенных компонентов (ГОСТ 8.315).
Калибровочный раствор - раствор компонента, приготовленный из стандартного образца состава и необходимый для проведения испытания.
3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов А (СЭА) или В (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235* и 42-236*, ВС 89), а также энтеротоксины типов А, В, С, D и Е при совместном дифференцированном и недифференцированном определении
________________
* Документы является авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.
(Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).
3.2. Принцип метода. Определение СЭТ происходит за счет специфического взаимодействия стафилококковых иммуноглобулинов к различным типам СЭТ, адсорбированных на планшете, со стафилококковыми энтеротоксинами, содержащимися в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антитело + антиген" выявляют с помощью конкурирующих стафилококковых иммуноглобулинов (конъюгатов), меченых пероксидазой. Образующийся аналитический сигнал, зависящий от результатов взаимодействия комплекса "антитело + антиген" с конъюгатом на поверхности ячеек планшета и выражающийся в ферментации субстрата - ортофенилендиамина (при раздельном определении СЭТ типов А и В) или тетраметилбензидина (при совместном определении СЭТ типов А, В, С, D и Е) с изменением его окраски, измеряется по регистрируемому значению оптической плотности при длинах волн 492 и 450 нм, соответственно. Схема анализа представлена в табл.1
Таблица 1
Схема анализа
Последовательность этапов ИФА при определении стафилококковых энтеротоксинов |
Отбор, подготовка проб и экстракция СЭА и СЭВ |
Сенсибилизация планшетов иммуноглобулинами |
Отмывка планшетов от непрореагировавших иммуноглобулинов |
Взаимодействие иммуноглобулинов с антигеном (СЭА или СЭВ) |
Отмывка планшетов от непрореагировавшего антигена |
Взаимодействие комплекса "антиген-антитело" с конъюгатом |
Отмывка планшетов от непрореагировавшего конъюгата |
Внесение субстрата |
Учет результатов |
3.3. Для проведения раздельного определения используются тест-системы иммуноферментные для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В в виде лиофилизированных компонентов.
3.4. Для проведения совместного определения СЭТ используются тест-системы иммуноферментные для одновременного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С, D, Е с использованием набора реагентов RIDASCREEN SET А, В, С, D, Е или других зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке тест-систем иммуноферментных с аналогичными характеристиками.
3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой.
(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).
3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов А, В, С, D, Е, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюорес-центного анализа.
(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).
3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке.
(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).
При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019*, а также требования, изложенные в технической документации на приборы.
______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 12.1.019-2009. - Примечание изготовителя базы данных.
Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:
не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;
не использовать поврежденные стрипы;
не использовать набор по истечении срока годности;
не смешивать реактивы из различных партий;
положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу;
реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления;
пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;
анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.
Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.
Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:
температура окружающего воздуха (20±5) °С;
атмосферное давление (97±10) кПа;
относительная влажность (65±15)%.
Раздел 4. (Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).
Фотометр вертикального типа с диапазоном измерения оптической плотности 0,0-2,5 в комплекте с интерференционным светофильтром для длин волн 490-492 нм и 450 нм | ||
Центрифуга лабораторная | ||
Шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры (130±5) °С по НД | ||
Шкаф холодильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры по НД | ||
Весы лабораторные аналитические общего назначения и образцовые с наибольшим пределом взвешивания 200 г, не ниже 2-го класса точности | ||
_______________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 53228-2008. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Дозаторы пипеточные автоматические с диапазоном объема доз 20-200 мкл, 200-1000 мкл и дискретности установки доз 5 мкл | ТУ 64-16-55-90* | |
________________ * ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Дистиллятор типа ДЭ-4-2 по НД | ||
рН-метр по НД | ||
Гомогенизатор ножевой или перистальтический типа "Стомайкер" | ||
Ступки фарфоровые с пестиками | ||
Автоматический иммуноферментный анализатор типа VIDAS BioMerieux® или mini VIDAS BioMerieux ®, Франция или аналогичного типа |