МР 01.019-07

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста "Эколюм"

1. Методические рекомендации разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Донерьян Л.Г.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов B.C.),  ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В, Ластенко Н.С., Федосеева Т.А).

2. С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации "Определение общей токсичности почв с помощью бактериального теста "Эколюм" от 8 июня 2000 г. МР N 11-134-09.

УТВЕРЖДЕНЫ Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.

1. Назначение и область применения

Настоящий документ устанавливает методику быстрого и количественного контроля степени интегральной химической токсичности водных вытяжек из почвы. Тест-система представлена биосенсорами серии "Эколюм" и измерительным прибором серии "Биотокс-10". Тест-система реагирует на токсичные соединения разнообразной химической природы и смеси веществ.

Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.

Опасность загрязнения почв определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды (вода, воздух), пищевые продукты и прямо или косвенно на человека.

Результаты обследования учитывают при определении и прогнозе степени опасности почв для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, технических решений по реабилитации и охране территорий, оценке эффективности санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарно-эпидемиологического надзора за объектами, воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.

2. СанПиН 2.1.7.1287-03 "Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы!".

3. ГОСТ 27793-88* (СТ СЭВ 5298-85) "Почвы. Термины и определения".     

_______________
     * Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ 25793-88, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

4. ГОСТ 17.2.2.01-81* (СТ СЭВ 4470-84) "Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей санитарного состояния".

 ______________

* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ 17.4.2.01-81, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

5. ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

6. ГОСТ 17.4.3.03-85 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".

7. ГОСТ 17.4.4.02-84 "Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб почвы для химического, бактериологического и гельминтологического анализа".

8. ГОСТ 17.4.3.06-86 (СТ СЭВ 5101-85) "Охрана природы. Почвы. Общие требования к классификации почв по влиянию на них химических загрязняющих веществ".

3. Термины и определения

Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды.

Химическое загрязнение почвы - изменение химического состава почвы, возникшее под прямым или косвенным воздействием антропогенного фактора (промышленного, сельскохозяйственного, коммунального и т.п.), вызывающее снижение ее качества и возможную опасность для здоровья человека.

Фоновые почвы - почвы территорий, не подвергающихся техногенному воздействию или испытывающих его в минимальной степени.

Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество окружающей среды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности объектов при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности изучаемого объекта. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

4. Принцип методики

Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с контролем. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

5. Количественная оценка параметров тест-реакции

Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30-ти минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.

Индекс токсичности "", равный отношению , где и соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биосенсором.

Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения и , позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).

ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец имеет допустимую степень токсичности.

Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой , где и соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График -функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте.

Люминометр "Биотокс-10" автоматически вычисляет величину индекса токсичности и параметры ЕС20 и ЕС50.

Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:

- допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе меньше величины ЕС20;

- образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;

- острая токсичность образца: индекс токсичности равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) равен или больше величины ЕС50.

6. Оборудование, материалы, реактивы

1. Лиофилизированный биосенсор "Эколюм", ТУ 2639-236-00209792-01;

2. Прибор серии "Биотокс-10", сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31,003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;

3. Весы лабораторные общего назначения. ГОСТ 24104;

    4. рН-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;

5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы - 0,5 °С, ГОСТ 215;

6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;

7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (2-4 °С);

8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;

9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;

10. Буры почвенные, ножи почвенные, ГОСТ 2307;

11. Лопаты, ГОСТ 19596;

12. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;

13. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02-0,5 мл ±1,0%;

14. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;

15. Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;

16. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;

17. Пробоотборник любого типа, объемом не менее 5 мл;

18. Флаконы и банки стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;

19. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;

20. Стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148;

21. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;

22. Кислота соляная, ГОСТ 3118;

23. Кислота серная, ГОСТ 4204;