ГОСТ Р 52173-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения (Переиздание)
7 Проведение анализа
7.1 В первые две пробирки с реакционной смесью N 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1.1-6.2.1.7, по 2 мм в каждую.
В третью пробирку с реакционной смесью N 1 и в третью пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0), пo 2 мм в каждую.
В четвертую пробирку с реакционной смесью N 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), пo 2 мм в каждую.
В пятую пробирку с реакционной смесью N 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью N 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм в каждую - холостой опыт.
7.2 В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20-40 мм) вазелинового масла по ГОСТ 3164.
7.3 Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.
Таблица 1 - Условия амплификации для 35S промотора
Стадия | Тип амплификатора | ||||
Crocodile II | Gene Amp 2400 | Progene | Trio | Терцик МС-2 | |
Денатурация | 2 мин/98°С | 3 мин/94°С | 3 мин/95°С | 2 мин/96°С | 3 мин/94°С |
Амплификация | 8 с/95°С | 20 с/94°С | 36 с/95°С | 30 с/95°С | 20 с/94°С |
30 с/54°С | 40 с/54°С | 72 с/54 °С | 40 с/54°С | 40 с/54°С | |
40 с/72°С | 60 с/72°С | 84 с/72°С | 40 с/72°С | 60 с/72°С | |
Количество циклов | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
Конечное удлинение | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С |
Фаза остывания | 1 мин/30°С | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С |
Скорость нагрева | 1°С/с | 0,77°С/с | 1,5°С/с | 1°С/с | 0,77°С/с |
Скорость остывания | 1°С/с | 3,15°С/с | 1,5°С/с | 1 °С/с | 3,15°С/с |
Таблица 2 - Условия амплификации для терминатора nos
Стадия | Тип амплификатора | ||||
Crocodile II | Gene Amp 2400 | Progene | Trio | Терцик МС-2 | |
Денатурация | 3 мин/95°С | 3 мин/94°С | 3 мин/95°С | 2 мин/98°С | 3 мин/94°С |
Амплификация | 20 с/95°С | 20 с/94 °С | 36 с/95°С | 30 с/95°С | 20 с/94°С |
40 с/54°С | 40 с/54°C | 72 с/54°С | 40 с/54°С | 40 с/54°С | |
40 с/72°С | 60 с/72°С | 84 с/72°С | 40 с/72°С | 60 с/72°С | |
Количество циклов | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
Конечное удлинение | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С |
Фаза остывания | 1 мин/30°С | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С |
Скорость нагрева | 1°С/с | 0,77°С/с | 1,5°С/с | 1°С /с | 0,77°С/с |
Скорость остывания | 1°С/с | 3,15°С /с | 1,5°С/с | 1°С/с | 3,15°С/с |
7.4 По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.
7.5 В отдельный карман геля вносят 8 мм маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].
7.6 Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1хТБЕ.
Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.
7.7 Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].
7.8 Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б.