Действующий

ГОСТ Р 52173-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения (Переиздание)

     7 Проведение анализа

7.1 В первые две пробирки с реакционной смесью N 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1.1-6.2.1.7, по 2 мм в каждую.

В третью пробирку с реакционной смесью N 1 и в третью пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0), пo 2 мм в каждую.

В четвертую пробирку с реакционной смесью N 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), пo 2 мм в каждую.

В пятую пробирку с реакционной смесью N 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью N 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм в каждую - холостой опыт.

7.2 В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20-40 мм) вазелинового масла по ГОСТ 3164.

7.3 Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.


 Таблица 1 - Условия амплификации для 35S промотора

Стадия

Тип амплификатора

Crocodile II

Gene Amp 2400

Progene

Trio

Терцик МС-2

Денатурация

2 мин/98°С

3 мин/94°С

3 мин/95°С

2 мин/96°С

3 мин/94°С

Амплификация

8 с/95°С

20 с/94°С

36 с/95°С

30 с/95°С

20 с/94°С


30 с/54°С

40 с/54°С

72 с/54 °С

40 с/54°С

40 с/54°С


40 с/72°С

60 с/72°С

84 с/72°С

40 с/72°С

60 с/72°С

Количество циклов

40

40

40

40

40

Конечное удлинение

3 мин/72°С

3 мин/72°С

3 мин/72°С

3 мин/72°С

3 мин/72°С

Фаза остывания

1 мин/30°С

1 мин/4°С

1 мин/4°С

1 мин/4°С

1 мин/4°С

Скорость нагрева

1°С/с

0,77°С/с

1,5°С/с

1°С/с

0,77°С/с

Скорость остывания

1°С/с

3,15°С/с

1,5°С/с

1 °С/с

3,15°С/с



Таблица 2 - Условия амплификации для терминатора nos

Стадия

Тип амплификатора


Crocodile II

Gene Amp 2400

Progene

Trio

Терцик МС-2

Денатурация

3 мин/95°С

3 мин/94°С

3 мин/95°С

2 мин/98°С

3 мин/94°С

Амплификация

20 с/95°С

20 с/94 °С

36 с/95°С

30 с/95°С

20 с/94°С


40 с/54°С

40 с/54°C

72 с/54°С

40 с/54°С

40 с/54°С


40 с/72°С

60 с/72°С

84 с/72°С

40 с/72°С

60 с/72°С

Количество циклов

40

40

40

40

40

Конечное удлинение

3 мин/72°С

3 мин/72°С

3 мин/72°С

3 мин/72°С

3 мин/72°С

Фаза остывания

1 мин/30°С

1 мин/4°С

1 мин/4°С

1 мин/4°С

1 мин/4°С

Скорость нагрева

1°С/с

0,77°С/с

1,5°С/с

1°С /с

0,77°С/с

Скорость остывания

1°С/с

3,15°С /с

1,5°С/с

1°С/с

3,15°С/с

7.4 По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.

7.5 В отдельный карман геля вносят 8 мм маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].

7.6 Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1хТБЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.

7.7 Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].

7.8 Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б.