ГОСТ 13106-67 Кожевенное сырье. Метод гистолого-бактериоскопического контроля (с Изменением N 1)

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Фиксация материала

Из отобранной пробы вырезают не менее четырех кусочков размером 1х1 см. Кусочки освобождают от грязи и шерсти, фиксируют в растворе формалина, для чего подогревают в течение 5 мин в 10%-ном растворе формалина при 50 °С, а затем переносят в 20%-ный раствор формалина и снова подогревают в течение 5 мин.

3.2. Приготовление срезов

Перед приготовлением микросрезов кусочки промывают в проточной воде в течение 30 мин и режут на замораживающем микротоме на срезы толщиной 25-30 мк. Срезы делают в вертикальном и тангенциальном направлении. Тангенциальные срезы производят из трех слоев: сосочкового, сетчатого и подкожно-жировой клетчатки.

Срезы каждого слоя помещают в отдельную чашечку с дистиллированной водой.

3.3. Окраска срезов

3.3.1. Для выявления состояния ткани и наличия микробов срезы окрашивают сначала метиленовым голубым с эозином.

Приготовляют свежую смесь равных частей 1%-ного спиртового раствора метиленового голубого и 1%-ного спиртового раствора эозина. Полученную смесь разбавляют в два раза дистиллированной водой и добавляют четыре капли "синьки Мансона", т.е. созревшего раствора метиленового голубого с бурой (100 см дистиллированной воды нагревают до 80 °С, вносят 2 г буры, затем прибавляют 1 г метиленового голубого; один раз раствор должен вскипеть). Из чашек срезы переносят в свежеприготовленную смесь красок на 5-10 мин.

После окраски срезы промывают дистиллированной водой, дифференцируют быстрым погружением в подкисленной воде (1-2 капли уксусной кислоты на 10 см), ополаскивают и последовательно переносят в следующие смеси ацетоно-ксилола на 2-5 мин в каждую:

а) смесь - 95 частей ацетона и 5 частей ксилола;

б) смесь - 70 частей ацетона и 30 частей ксилола;

в) смесь - 30 частей ацетона и 70 частей ксилола.

Затем срезы переносят в чистый ксилол на 1-2 мин (срезы должны упасть на дно). Окрашенные и обезвоженные срезы заключают в канадский бальзам под покровное стекло.

3.3.2. Окраску срезов эластиновых волокон производят орсеином (кристаллическим) или по Вайгерту.

Для приготовления раствора орсеина 1 г вещества растворяют в 100 см 96%-ного этилового спирта и к раствору приливают 1 см химически чистой соляной кислоты.

Для окраски срезов по Вайгерту 2 г основного фуксина растворяют в 200 см дистиллированной воды, прибавляют 4 г резорцина и кипятят в фарфоровой чашечке, помешивая стеклянной палочкой несколько минут, затем прибавляют 25 см 30%-ного раствора полуторахлористого железа и кипятят еще 5-10 мин, помешивая палочкой. Затем раствору дают остыть и отфильтровывают его через влажный бумажный фильтр. Фильтрат выливают, а фильтр с осадком помещают в ту же фарфоровую чашку, в которой производилось кипячение краски, и заливают 200 см 96%-ного этилового спирта. Чашку помещают на водяную баню или лучше на электрическую плитку и кипятят 5-10 мин, помешивая стеклянной палочкой, пока весь осадок не сойдет с фильтра. Фильтр вынимают, спирт выпаривают в течение 5-10 мин, чашку с раствором покрывают стеклянной пластинкой и охлаждают. После охлаждения раствор фильтруют в измерительный цилиндр, доливают до 200 см 96%-ным спиртом и прибавляют 4 см 25%-ного раствора химически чистой соляной кислоты.

Микросрезы опускают в фуксин Вайгерта на 15-20 мин (в случае орсеина 30 мин), проводят через специальную батарею спиртов возрастающей крепости (80%-ный, 96%-ный, абсолютный спирт) карболксилол и ксилол, после чего срезы переносят на предметное стекло и заключают в канадский бальзам под покровное стекло.