3.1. Сущность метода
Сущность метода основана на кислотном и ферментативном гидролизе связанных форм витамина, окислении пигментов марганцовокислым калием, восстановлении рибофлавина гидросульфитом натрия и измерении интенсивности флуоресценции до и после восстановления при длинах волн 360-480 нм возбуждающего и 510-650 нм излучаемого света.
Метод предназначен для анализа слабоокрашенных овощных, фруктовых и ягодных консервированных продуктов.
3.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п.2.2, со следующими дополнениями.
Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.
Колбы лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см
.
Водорода перекись по ГОСТ 10929, раствор с массовой долей 3%. Срок хранения семь дней.
Калий марганцовокислый по ГОСТ 20490, раствор с массовой долей 3%. Срок хранения семь дней.
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор с массовой долей 93,6-95,6%.
Натрия гидросульфит технический по ГОСТ 246.
Рибофлавин, растворы с массовыми концентрациями 0,02 и 0,001 г/дм.
3.3. Подготовка к анализу
3.3.1. Приготовление стандартного раствора рибофлавина
Раствор готовят из рибофлавина следующим образом: предварительно высушивают рибофлавин в вакуум-эксикаторе над концентрированной серной кислотой. Раствор с концентрацией 0,02 г/дм хранят в холодильнике в течение месяца. Раствор с концентрацией 0,001 г/дм готовят в день проведения анализа.
Для приготовления стандартного раствора рибофлавина с массовой концентрацией 0,02 г/дм в мерную колбу вместимостью 1000 см помещают 0,020 г рибофлавина, прибавляют около 750 см дистиллированной воды, 1,0 см ледяной уксусной кислоты и слегка нагревают при перемешивании до растворения. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки дистиллированной водой и снова перемешивают.
Для приготовления раствора рибофлавина с массовой концентрацией 0,001 г/дм отбирают 5,0 см раствора с массовой концентрацией 0,02 г/дм в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят до метки дистиллированной водой и перемешив
ают.
3.3.2. Приготовление гидролизата
Приготовление гидролизата проводят по п.2.3.4, с дополнением, указанным ниже.
Для определения поправки на содержание витамина В
в ферментах одновременно проводят контрольный опыт. В мерную колбу вместимостью 250 см помещают 150 см раствора соляной кислоты 
(НСl)=0,1 моль/дм, устанавливают с помощью раствора уксуснокислого натрия величину рН 4,2-4,5. Прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х или по 0,10 г амилоризина П10Х и пектаваморина П10Х и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 12-16 ч.
При использовании амилоризина П10Х и пепсина в колбу с раствором соляной кислоты (НСl)=0,1 моль/дм прибавляют сначала 0,10 г пепсина и выдерживают в термостате 4 ч при той же температуре. Затем устанавливают величину рН 4,2-4,5, прибавляют 0,10 г амилоризина П10Х и снова выдерживают 12-16 ч при 37 °С. После этого содержимое колбы охлаждают, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют.
Контрольный опыт проводят один раз для каждой партии ферментов
.
3.4. Проведение анализа
3.4.1. В две колбы вместимостью 50 см каждая помещают по 10,0 см гидролизата пробы, в третью колбу - 10,0 см гидролизата контрольного опыта. В одну колбу с анализируемым гидролизатом прибавляют 1,0 см стандартного раствора рибофлавина с концентрацией 0,001 г/дм, в две другие - по 1,0 см дистиллированной воды. Во все колбы прибавляют по 1,0 см ледяной уксусной кислоты, 0,50 см раствора марганцовокислого калия, перемешивают и выдерживают 2 мин. Затем прибавляют по 0,50 см раствора перекиси водорода и снова перемешивают. Через 5 мин измеряют интенсивность флуоресценции сначала раствора с добавкой рибофлавина, затем раствора без добавки и контрольного опыта. Измерение интенсивности флуоресценции каждого раствора производят сначала без прибавления гидросульфита натрия, затем после его прибавления. Гидросульфит натрия прибавляют порциями по 0,02-0,05 г, быстро перемешивают и снова производят измерение. Эту операцию повторяют до установления наименьшей интенсивности флуоресценц
ии.
