МУ 1.2.3364-16
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
1.2. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ
Оценка мутагенной активности пестицидов
Дата введения 2016-07-04
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А.Ю.Попова 4 июля 2016 г.
1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана" Роспотребнадзора (академик РАН, профессор B.Н.Ракитский; д.б.н., профессор Ю.А.Ревазова; к.б.н. Н.А.Илюшина; к.б.н. О.В.Егорова; д.м.н., профессор Т.А.Синицкая; д.м.н., профессор Е.Г.Чхвиркия); ФГБУ "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина" (д.м.н., профессор В.С.Журков; д.б.н., профессор Л.П.Сычева); ФГБНУ "Научно-исследовательский институт фармакологии им.В.В.Закусова" (профессор, член-корр. РАН, А.Д.Дурнев, к.б.н. А.К.Жанатаев); ФГБУН "Институт общей генетики им.Н.В.Вавилова" РАН (д.б.н., профессор C.К.Абилев).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю.Поповой 4 июля 2016 г. и введены в действие с момента утверждения.
4. Введены впервые.
1. Область применения
Настоящие методические указания устанавливают порядок проведения комплексной оценки мутагенной активности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов согласно требованиям отечественных и международных нормативных правовых документов.
Методические указания предназначены для использования при токсиколого-гигиенической оценке пестицидов для установления класса опасности по показателю "мутагенность" и разработке мер по предотвращению их неблагоприятного влияния на здоровье населения и повышению надежности разрабатываемых гигиенических нормативов и регламентов применения пестицидов.
Методы оценки мутагенной активности пестицидов применимы в случаях:
- регистрации и перерегистрации пестицидов;
- изменения состава или вида препаративной формы;
- разработки гигиенических нормативов и регламентов применения;
- проведения эпидемиологических исследований в регионах с повышенной пестицидной нагрузкой.
Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также научно-исследовательских организаций, лабораторий и кафедр гигиенического профиля, занимающихся оценкой опасности пестицидов на всех этапах их обращения и гигиеническим нормированием пестицидов в объектах окружающей среды.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (с изменениями и дополнениями).
2.2. Федеральный закон от 19 июля 1997 г. N 109-ФЗ "О безопасном обращении с пестицидами и агрохимикатами" (с изменениями и дополнениями).
2.3. Федеральный закон от 21 июля 2012 г. N 126-ФЗ "О ратификации Протокола присоединения Российской Федерации к Маракешскому соглашению об учреждении Всемирной торговой организации" от 15 апреля 1994 г. с приложениями.
2.4. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утвержденные Решением Комиссии Таможенного союза от 28 мая 2010 г. N 299.
2.6. Санитарные правила и нормативы СанПиН 1.2.2584-10 "Гигиенические требования к безопасности процессов испытаний, хранения, перевозки, реализации, применения, обезвреживания и утилизации пестицидов и агрохимикатов, утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 2 марта 2010 г.
2.8. Руководство Р 1.2.3156-13 "Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека", утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ 27 декабря 2013 г.
2.9. ГОСТ 32376-2013 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки обратных мутаций на бактериях", введенный в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 805-ст.
2.10. ГОСТ 32635-2014 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro", введен в действие 01.06.2015.
3. Термины и определения
Аберрации хроматидного типа - структурные нарушения на уровне одной хроматиды, выявляемые как одиночные фрагменты или хроматидные обмены.
Аберрации хромосомного типа - структурные нарушения на уровне идентичных локусов обеих хроматид, выявляемые как парные фрагменты и хромосомные обмены.
Анеуген - любое соединение, которое, взаимодействуя с компонентами цикла деления митотических и мейотических клеток, приводит к анеуплоидии в клетках или организмах.
Анеуплоидия - любое отклонение от нормального диплоидного (или гаплоидного) числа хромосом на одну или более хромосом, но не на полный набор хромосом (полиплоидия).
Ахроматические пробелы (гепы) - определяемые визуально нарушения целостности окраски хроматиды, не превышающие по размеру ее ширины и не сопровождающиеся сдвигом дистального участка относительно ее оси.
Длина хвоста - показатель поврежденности ДНК, определяемый расстоянием между концом профиля головы и концом профиля хвоста.
Индекс пролиферации при блоке цитокинеза (CBPI) - доля клеток второго деления в обработанной популяции относительно контроля без обработки.
Индекс репликации (RI) - доля завершенных циклов клеточного деления в обработанных культурах по отношению к культурам без обработки в течение периода экспозиции и восстановления.
Кластоген - любое соединение, которое вызывает структурные хромосомные аберрации в популяции клеток или организмов.
Комета - структура, формируемая ДНК клетки, лизированной в агарозном геле, под действием электрического поля.
Метод ДНК-комет (гель-электрофорез отдельных клеток) - метод регистрации первичных повреждений ДНК на уровне ДНК отдельных клеток/ядер.
Микроядерный тест - определение частоты клеток с микроядрами и числа микроядер на клетку.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана- и телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественые микроядра в цитоплазме.
Митотический индекс - отношение числа клеток в метафазе к общему числу клеток в наблюдаемой клеточной популяции; показатель клеточной пролиферации в данной популяции.
Момент хвоста - показатель поврежденности ДНК, определяемый произведением процента ДНК (%ДНК) в хвосте и длины хвоста ДНК-кометы.
Момент хвоста по Оливе - показатель поврежденности ДНК, определяемый произведением %ДНК в хвосте и расстояния между центрами плотности головы и хвоста ДНК-кометы.
Мутагены, индуцирующие замены пар оснований, - агенты, вызывающие мутации типа замены пар оснований в молекуле ДНК. В данном тесте эти мутации могут происходить или в сайте исходной мутации, или в другом сайте хромосомы.
Мутагены, индуцирующие мутации типа сдвига рамки считывания - агенты, вызывающие вставку или делецию одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма.
Нормохроматофильный эритроцит - (син. нормохроматофил, НХЭ) зрелый эритроцит, окрашивается в красновато-розовый цвет.
Относительное увеличение количества клеток (RICС) - увеличение числа клеток в опытных культурах относительно увеличения числа клеток в контрольных культурах в процентах, показатель цитотоксичности в методиках, при которых не используют цитохалазин В.
Относительное удвоение популяции клеток (RPD) - удвоение популяции в опытных культурах относительно удвоения популяции в контрольных культурах в процентах, показатель цитотоксичности в методиках, при которых не используется цитохалазин В.
Полихроматофильный эритроцит - (син. полихроматофил, ПХЭ) незрелый эритроцит, цитоплазма которого вследствие неполного насыщения ее гемоглобином окрашивается одновременно как кислыми, так и основными красителями, приобретая серо-фиолетовый цвет.
Пролиферативный индекс (РI) - процент делящихся клеток, показатель цитотоксичности в методиках, при которых не используется цитохалазин В.
Процентное содержание ДНК в хвосте (%ДНК в хвосте) - показатель поврежденности ДНК, определяемый отношением интенсивности флуоресценции хвоста к общей интенсивности флуоресценции ДНК-кометы в процентах.
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Эндоредупликация - удвоение хромосом в интерфазе, не сопровождающееся митотическим делением. В следующем цикле в ядре могут обнаруживаться диплохромосомы, состоящие из четырех хроматид.
4. Оценка мутагенной активности пестицидов
Применение химических средств защиты растений может быть одной из причин интенсивного роста химического загрязнения окружающей и производственной среды. Проблема оценки степени опасности пестицидов является одной из ключевых проблем при проведении предупредительного и текущего санитарного надзора, при внедрении и дальнейшем применении новых препаратов.
Пестициды различных групп характеризуются рядом особенностей, в том числе высокой биологической активностью, преднамеренностью их внесения в окружающую среду, неизбежностью циркуляции в ней, возможностью контакта широких слоев населения с остаточными количествами пестицидов. Среди неблагоприятных воздействий особое место занимает потенциальная мутагенность действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов. Поэтому важной задачей является предотвращение неблагоприятного мутагенного действия пестицидов на здоровье населения. В связи с этим анализ мутагенной активности пестицидов и их основных метаболитов является обязательной составной частью их токсиколого-гигиенической оценки при установлении класса опасности (СанПиН 1.2.2584-10) и прогнозировании возможных отдаленных эффектов, а также для обеспечения надежности разрабатываемых гигиенических нормативов и регламентов применения пестицидов.
В оценке биологического действия пестицидов большое значение имеют чувствительность, специфичность и доступность методов, с помощью которых можно в довольно короткие сроки изучить мутагенную активность действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их отдельных компонентов.
В соответствии с действующим порядком государственной регистрации пестицидов и агрохимикатов предусмотрена оценка индукции генных, хромосомных и/или геномных мутаций с помощью методов, соответствующих международным стандартным протоколам. Для определения способности пестицидов индуцировать мутации разных типов необходимо использование комплекса методов, выполняемых на разных тест-объектах.
В методических указаниях впервые представлена гармонизированная с международными требованиями комплексная система проверки генетической активности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов на этапе токсикологических исследований на различных тест-объектах в опытах in vitro и in vivo для установления класса опасности по данному признаку вредности в соответствии с гигиенической классификацией пестицидов и агрохимикатов по степени опасности (СанПиН 1.2.2584-10) и разработки гигиенических нормативов содержания пестицидов в объектах окружающей среды с учетом мутагенности для обеспечения их безопасного обращения.
4.1. Описание системы оценки мутагенной активности
Изучение мутагенности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов наряду с другими возможными отдаленными последствиями (эмбриотоксичность и тератогенность, репродуктивность, канцерогенность) проводят на этапе токсикологических исследований. Эта работа предусматривает оценку способности пестицидов к индукции мутаций разных типов и делает необходимым использование для оценки мутагенных свойств комплекса методов, выполняемых на разных тест-объектах. Основой создания предлагаемой системы оценки мутагенности является опыт работы отечественных исследователей по тестированию мутагенности пестицидов, накопленный с момента выхода первых отечественных методических рекомендаций, а также существующие в настоящее время международные регламенты проведения экспериментальных работ.
В батарею тестов анализа мутагенности пестицидов и компонентов препаративных форм следует включать методы оценки индукции генных мутаций (тест Эймса), методы оценки цитогенетических повреждений (учет хромосомных аберраций или микроядер в клетках in vivo или in vitro) и методы оценки повреждений ДНК (метод гель-электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет) in vivo и in vitro).
Все перечисленные методы в рамках каждого изучаемого типа генетических нарушений являются взаимозаменяемыми, что соответствует современным международным требованиям и подходам. В случае проведения эпидемиологических наблюдений в зонах высокой пестицидной нагрузки целесообразно применение методов учета хромосомных аберраций, оценки повреждений ДНК в лимфоцитах периферической крови человека и учет микроядер в клетках буккального эпителия.
Изучение генетической активности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов требует профессиональной подготовки.
Данные методические указания описывают комплексную систему проверки генетической активности пестицидов, но не являются пособием для освоения методов. Последние в должном объеме можно освоить только в результате стажировки в лабораториях соответствующего профиля. Дополнения и уточнения регламента выполнения рекомендованных методов и трактовка экспериментальных результатов описаны в соответствующих разделах.
4.2. Принципы отбора пестицидов, препаративных форм и их компонентов для испытания на мутагенную активность
Тестированию на мутагенную активность подвергаются новые оригинальные действующие вещества и дженерики пестицидов, которые могут быть использованы как гербициды, инсектициды, нематоциды, акарициды, фунгициды, репелленты, регуляторы роста растений и др., созданные химическими, биотехнологическими, генно-инженерными и иными способами, включая полученные из сырья природного происхождения, а также их препаративные формы и отдельные компоненты препаративных форм. Новые фиксированные комбинации пестицидов, планируемые для широкого применения в сельском хозяйстве, при структурном сходстве компонентов комбинации с известными канцерогенами, мутагенами или их метаболитами также подвергаются испытанию. Для анализа структурного сходства используют, во-первых, представительную базу данных о мутагенных свойствах широкого круга химических соединений и, во-вторых, специальные компьютерные программы.
5. Пути введения пестицидов, выбор доз, объекты исследования
5.1. Исследования in vivo
Пути введения исследуемого пестицида или препаративной формы in vivo должны соответствовать основным путям поступления их в организм.
Попробуйте «Техэксперт: Лаборатория. Инспекция. Сертификация» бесплатно