ГОСТ 32635-2014

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ


МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro

Methods of testing the impact of chemicals on a human hazard. In vitro mammalian cell micronucleus test

МКС 13.020.01

 Дата введения 2015-06-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила, рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ" (ФГУП "ВНИЦСМВ"); Техническим комитетом по стандартизации N 339 "Безопасность сырья, материалов и веществ" Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2014 г. N 67-П)

За принятие проголосовали:

4  Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 сентября 2014 г. N 1233-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32635-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2015 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD Test N 487:2010* "Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro" ("In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test", IDT).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Сентябрь 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Микроядерный тест in vitro (МЯТ) - метод оценки генотоксичности по выявлению микроядер в цитоплазме интерфазных клеток. Микроядра могут образовывать ацентрические фрагменты хромосом (т.е. с отсутствием центромеры) или целые хромосомы, которые не способны мигрировать к полюсам на стадии анафазы клеточного деления. Метод оценивает кластогенную и анеугенную активность химических веществ [2, 3] в клетках, которые проходят клеточное деление во время или после экспозиции исследуемого вещества. Данное руководство касается использования протоколов без или с применением ингибитора актин полимеразы цитохолазина В (ЦХБ)*. Добавление ЦХБ* перед изучаемым митозом позволяет идентифицировать и проводить анализ частоты микроядер в клетках, которые прошли один митоз, т.к. такие клетки двуядерны [4, 5]. Это руководство также дает описание протокола без блока цитокинеза при условии наличия данных, что анализируемая клеточная популяция митотически активна.

__________________

* Текст документа соответствует оригиналу. Далее по тексту в бумажном оригинале приводится обозначение ЦХВ. - Примечание изготовителя базы данных.  

В дополнение к использованию МЯТ для идентификации индуцирующих микроядра химических веществ, цитокинезный блок, иммунохимическое мечение кинетохоров или гибридизация с центромерными/теломерными зондами [флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)] позволяют получить информацию по механизмам хромосомных нарушений и образования микроядер [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Процедуры мечения и гибридизации можно использовать в случаях, когда имеется повышение образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является ли это возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных событий.

Микроядра представляют собой нарушения хромосом, которые передаются дочерним клеткам, тогда как аберрации хромосом, анализируемые в метафазных клетках, могут не передаваться. Поскольку выявление микроядер в интерфазных клетках достаточно объективно, сотрудникам лабораторий необходимо определить прошла или не прошла клетка клеточное деление и как много клеток содержит микроядра. В результате анализ препаратов проводится относительно быстро и может быть автоматизирован. На практике это позволяет анализировать тысячи, а не сотни клеток на экспериментальную точку, увеличивая силу метода. Наконец, поскольку микроядра могут образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность выявлять агенты, индуцирующие анеуплоидию, что трудно оценивать в стандартном тесте на хромосомные аберрации (например, Руководство OECD 473 [18]). Однако МЯТ не позволяет выявлять вещества, индуцирующие полиплоидию, от веществ, которые индуцируют кластогенность, без специальных методик, таких как FISH.

МЯТ является методом in vitro, который проводится на культивируемых клетках человека и грызунов. Тест дает полное основание исследовать хромосомные нарушения in vitro, поскольку выявляет как анеугены, так и кластогены.

МЯТ надежен и эффективен в различных типах клеток как в присутствии, так и отсутствии ЦХВ. Имеется большое количество данных, показывающих приемлемость МЯТ при использовании различных линий клеток грызунов (СНО, V79, CHL/IU и L5178Y) и лимфоцитов человека [19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]. Они включают Международное исследование по валидации теста, координируемое the Francaise de Toxicologie (SFTG) [19, 20, 21, 22, 23] и доклады Международных совещаний по генетическому тестированию [5, 17]. Все приемлемые данные были также повторно оценены в weight-of-evidence ретроспективном валидационном исследовании Европейского центра по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской комиссии (ЕС). Метод тестирования был рекомендован как научно обоснованный ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) [33, 34, 35]. Имеются данные по использованию клеточной линии лимфобластных клеток человека ТК6 [36], HepG2 клеток [37, 38] и первичных эмбриональных клеток сирийского хомячка [39], хотя они не проходили валидизационное исследование.

     1 Область применения

Тесты in vitro обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации, за исключением клеток, которые метаболически компетентны в отношении исследуемых соединений. Система метаболической активации не может полностью воспроизводить условия, присутствующие у млекопитающих in vivo. Следует тщательно избегать условий, которые могут привести к результатам, не отвечающим реальной мутагенности. Позитивные результаты, не отвечающие реальной мутагенности, могут возникать вследствие изменения pH, осмотической концентрации, высокого уровня токсичности [41, 42]. Если исследуемое вещество вызывает изменение pH среды во время введения в культуру, pH должна быть скорректирована, предпочтительно забуферив исходный раствор. Таким образом, все объемы при всех концентрациях и все контроли будут иметь одинаковую pH.

Для анализа индукции микроядер необходимо, чтобы митозы были как в опытных, так и контрольных культурах. Для анализа микроядер наиболее информативной является стадия, при которой клетки прошли один митоз во время или после воздействия исследуемого вещества.

     2 Термины и определения

2.1 анеуген (aneugen): Любое соединение или процесс, которые, взаимодействуя с компонентами цикла деления митотических и мейотических клеток, приводят к анеуплоидии в клетках или организмах.

2.2 анеуплоидия (aneuploidy): Любое отклонение от нормального диплоидного (или гаплоидного) числа хромосом на одну или более хромосом, но не на полный набор хромосом (полиплоидия).

2.3 апоптоз (apoptosis): Запрограммированная клеточная гибель, характеризующаяся серией этапов, ведущих к дезинтеграции клеток в мембранно-связанные частицы, которые затем элиминируются фагоцитозом или выбросом.   

2.4 генотоксический (genotoxic): Общий термин, охватывающий все типы повреждений ДНК или хромосом, включающий разрывы, аддукты, перестройки, мутации, хромосомные аберрации и анеуплоидию. Не все типы генотоксических эффектов приводят к мутациям или стабильным хромосомным нарушениям.

2.5 индекс пролиферации при цитокинетическом блоке; CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation index; CBPI): Доля клеток второго деления в обработанной популяции относительно контроля без обработки (см. формулы в приложении А).

2.6 индекс репликации; Rl (Replication Index; RI): Доля завершенных циклов клеточного деления в обработанных культурах по отношению к культурам без обработки в течение периода экспозиции и восстановления (см. формулы в приложении А).

2.7 интерфазные клетки (Interphase cells): Клетки не в стадии митоза.

2.8 кинетохор (kinetochore): Белок-содержащая структура, которая расположена в центромере хромосомы, с которой во время клеточного деления связаны волокна веретена, позволяющие точно расходиться дочерним хромосомам к полюсам дочерних клеток.

2.9 клеточная пролиферация (cell proliferation): Увеличение числа клеток в результате митотического деления клеток.

2.10 кластоген (clastogen): Любое соединение или процесс, которые вызывают структурные хромосомные аберрации в популяции клеток или организмов.

2.11 микроядра (micronuclei): Небольшие ядерные образования, отделенные от основного ядра клетки, образовавшиеся во время телофазы митоза или мейоза в результате отставания хромосомных фрагментов или целых хромосом.

2.12 митоз (mitosis): Деление клеточного ядра, обычно подразделяющееся на профазу, прометафазу, метафазу, анафазу и телофазу.

2.13 митотический индекс (mitotic index): Отношение числа клеток в метафазе к общему числу клеток в наблюдаемой клеточной популяции; показатель клеточной пролиферации в данной популяции.

2.14 мутагенный (mutagenic): Образование наследуемых изменений последовательности пар оснований в ДНК или структуры хромосом (хромосомные аберрации).

2.15 нерасхождение (non-disjunction): Нарушение расхождения парных хроматид и правильной сегрегации при образовании дочерних клеток, приводящее к аномальному числу хромосом в дочерних клетках.

2.16 относительное возрастание количества клеток; RICC (Relative Increase in Cell Count; RICC): Метод измерения цитотоксичности в методиках, при которых не используется ЦХВ (см. формулы в приложении А).

2.17 относительное удвоение популяции; RPD (Relative Population Doubling; RPD): Метод измерения цитотоксичности в методиках, при которых не используется ЦХВ (см. формулы в приложении А).

2.18 полиплоидия (polyploidy): Численные нарушения хромосом в клетках или организмах, затрагивающие полный набор(ы) хромосом, в противоположность нарушениям по одной или нескольким хромосомам (анеуплоидия).

2.19 пролиферативный индекс; PI (Proliferation Index; PI): метод измерения цитотоксичности в методиках, при которых не используется ЦХВ (см. формулы в приложении А).

2.20 центромера (centromere): Участок ДНК хромосомы, где две хроматиды соединяются вместе и в котором оба кинетохора соединяются друг с другом.

2.21 цитокинез (cytokinesis): Процесс клеточного деления сразу после митоза, формирующий дочерние клетки, каждая из которых содержит одно ядро.

2.22 цитостатичность (cytostasis): Ингибирование роста клеток (см. формулы в приложении А).

2.23 цитотоксичность (cytotoxicity): Вредные эффекты на структуру или функцию клеток, в конечном счете приводящие к гибели клетки.

     3 Принцип исследования

Культуры клеток человеческого или животного происхождения обрабатывают исследуемым веществом как без, так и в присутствии экзогенного источника метаболической активации за исключением клеток с адекватными особенностями метаболизма. Во все тесты включают контроли с растворителем/разбавителем и позитивные контроли.

Во время и после воздействия исследуемым веществом клетки должны расти такой период времени, который достаточен для формирования из хромосомных нарушений и нарушений веретена деления микроядер в интерфазных клетках. Для индукции анеуплоидии вещество должно обычно присутствовать во время митоза. Микроядра анализируют в фиксированных и окрашенных интерфазных клетках. Идеально, микроядра следует анализировать только в тех клетках, которые закончили митоз во время экспозиции исследуемого вещества или в течение постэкспозиционного периода, если таковой используется. В культурах, которые обрабатывают блокатором цитокенеза, это достигается при анализе двуядерных клеток. В отсутствии блока цитокинеза важно показать, что анализируемые клетки прошли клеточное деление во время или после воздействия исследуемым веществом. Для всех протоколов важно показать, что пролиферация клеток была как в контрольных, так и опытных культурах. Степень индуцированных исследуемым веществом цитотоксичности и цитостатичности должна быть определена в культурах (или параллельных культурах), в которых анализируют микроядра.

     4 Описание метода

4.1 Материалы

Используют первичные культуры лимфоцитов периферической крови человека [6, 20, 43, 44] и ряд клеточных линий грызунов, таких как СНО, V79, CHL/IU и L5178Y [19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 31]. Использование других клеточных линий и типов должно быть научно обосновано по критериям, описанным в разделе "Критерии приемлемости". Так как спонтанная частота микроядер влияет на чувствительность метода, рекомендуется использовать типы клеток с низкой, стабильной спонтанной частотой образования микроядер.

Лимфоциты человека следует отбирать у молодых (возраст приблизительно 18-35 лет), здоровых, некурящих индивидов, которые не имели недавнего контакта с генотоксическими химическими веществами и радиацией. Если клетки более чем одного донора объединяют для использования, число доноров должно быть указано. Частота микроядер возрастает с возрастом индивидов и этот тренд более заметен у женщин, чем у мужчин [45]. Это следует принимать во внимание при отборе доноров для объединения.

4.2 Среды и условия культивирования