МУ 2.3.2.2789-10
2.3.2. ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ
Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов
Методические указания
1. Авторский коллектив: Научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Шевелёва, С.А.Хотимченко, В.А.Исаков, И.Я.Конь, В.К.Мазо, Н.Р.Ефимочкина, Э.Н.Трушина, С.Ю.Батищева, А.В.Черкашин, А.В.Булахов); Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН (Н.К.Янковский, В.Н.Даниленко, С.Г.Ботина, О.В.Аверина); ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Габричевского" Роспотребнадзора (В.А.Алешкин, Б.А.Шендеров, А.М.Амерханова, О.Г.Жиленкова, А.В.Алёшкин, М.С.Бляхер, И.М.Федорова, Е.А.Воропаева, Ю.В.Черепанова); ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.почетного академика РАМН Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития России (А.Л.Гинцбург, Ю.В.Ананьина, Б.С.Народицкий, Н.А.Зигангирова, Л.Н.Нестеренко, И.А.Шагинян, М.Ю.Чернуха, А.А.Ховаев); ГОУ ВПО Тверская государственная медицинская академия "Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации" (В.М.Червинец, Ю.В.Червинец); Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова (В.В.Зинченко, Е.А.Карбышева); при участии ВНИМИ РАСХН (В.Д.Харитонов, В.Ф.Семенихина, И.В.Рожкова, В.Г.Будрик), ООО "Бактотех" (А.И.Туркин).
2. Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).
3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 6 декабря 2010.
4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с момента утверждения.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
Введение
Опыт широкого применения пробиотиков в пищевой промышленности в целом подтверждает историю безопасного употребления в пищу человека микроорганизмов-симбионтов кишечной микрофлоры, к которым относится большинство пробиотиков, и отсутствие у них способности обусловливать у потребителей заболевания инфекционного и инвазионного характера. В то же время, как признают эксперты ФАО-ВОЗ, пробиотики потенциально могут быть ответственны за ряд побочных эффектов (септические инфекции, избыточная метаболическая активность, гиперстимуляция факторов локального иммунитета, передача генов представителям нормофлоры организма человека). Наибольшую актуальность в этом аспекте на сегодняшний день приобретает требование к контролю отсутствия у штаммов трансмиссивных генов, прежде всего антибиотикорезистентности.
Накопленные в области нутрициологии и микробиологии данные также свидетельствуют о штаммоспецифичности благоприятного воздействия пробиотиков на здоровье человека. В связи с этим согласно международным требованиям таксономическая принадлежность пробиотических штаммов должна устанавливаться с использованием современных воспроизводимых молекулярно-генетических методов. Подтверждение пробиотического потенциала стартерных культур пробиотиков должно быть основано на научной доказательной базе.
Настоящие методические указания разработаны с целью обеспечения единого, научно-обоснованного подхода к оценке качества и безопасности штаммов пробиотических микроорганизмов (далее - штаммов), предназначенных для производства пробиотических заквасок прямого внесения, бактериальных концентратов и микробной биомассы, являющейся компонентом пробиотических пищевых и биологически активных добавок или используемых для обогащения традиционных пищевых продуктов и биологически активных добавок; совершенствования нормативной базы, регулирующей оборот продукции, выработанной с использованием живых пробиотических микроорганизмов.
1. Область применения
1.1. Методические указания устанавливают требования к микробиологической, биохимической, молекулярно-генетической и гигиенической оценке штаммов, используемых в качестве стартовых культур для изготовления пробиотических заквасок, включая закваски прямого внесения, бактериальных концентратов и микробной биомассы для производства пробиотических пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, и необходимые методы лабораторных исследований для её осуществления.
1.2. Методические указания предназначены для юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, деятельность которых связана с разработкой, производством и обращением биотехнологической продукции, а также для испытательных лабораторных центров, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов и БАД к пище и аккредитованных в установленном порядке на данный вид деятельности.
2. Общие положения
2.1. Санитарно-эпидемиологическая оценка штаммов, отобранных по специфическим функциональным пробиотическим свойствам, включает в себя комплекс микробиологических, биохимических, молекулярно-генетических и гигиенических исследований для подтверждения их безопасности (безвредности), а также наличия у них свойств, обусловливающих пробиотический эффект в организме, и поэтому пригодных для создания пробиотических продуктов питаниями биологически активных добавок к пище.
2.2. Положения, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются при разработке технической документации на продукцию, а также на этапе предрегистрационных испытаний (исследований) впервые разрабатываемой или впервые ввозимой на территорию Российской Федерации продукции.
2.3. В составе пробиотических заквасочных культур, бактериальных концентратов и микробной биомассы для производства пробиотических пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, содержащих живые микроорганизмы, могут использоваться отдельные штаммы (или консорциумы штаммов), принадлежащие к родам бифидобактерий (Bifidobacterium spp.), лактобацилл (Lactobacillus spp.), пропионовокислых бактерий (Propionibacterium spp.) и др., за исключением родов и видов микроорганизмов, перечисленных в СанПиН 2.3.2.2567-09 "Дополнение 15 к СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
2.4. Для обеспечения безопасности и пригодности пробиотических пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище, содержащих живые микроорганизмы, штаммы для производства должны отвечать следующим требованиям:
2.4.1) должны быть преимущественно изолированы (без применения каких-либо биотехнологических воздействий на штамм) из представителей симбиотической резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта здоровых людей. В иных случаях и в случаях, когда потенциальная пробиотическая культура изолирована из пищевого продукта, организма животного или другого объекта окружающей среды, наряду с происхождением штамма, должен быть известен способ селекции (индуцированный мутагенез, адаптация к определенным факторам, генно-инженерные манипуляции, в том числе самоклонирование, и др.) этих микроорганизмов;
2.4.2) таксономическая принадлежность должна быть установлена до уровня штамма путем изучения широкого спектра фенотипических характеристик и подтверждена с использованием воспроизводимых молекулярно-генетических методов;
2.4.3) номенклатурное название штамма должно приводиться в соответствии с кодами современной международной классификации (по Approval Lists of Bacterial Names in International Journal of Systematic Bacteriology, 1980, v. 30, 225-420 http://www.bacterio.cici.fr/) или Validation Lists in the International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology) и включать обозначение рода, вида и штамма;
2.4.4) должны быть задепонированы в национальных или международных коллекциях микробных культур Российской Федерации на условиях контрольного хранения (для отечественных производителей - ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика или ФГУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского, Москва; для зарубежных - международная коллекция микроорганизмов при ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика), сопровождаться справкой о депонировании и паспортом штамма с указанием подробной таксономической характеристики, источника и даты выделения, анатомической области изоляции, присущих штамму фенотипических и генетических характеристик, в т.ч. наличия внехромосомного генетического материала. Форма паспорта на штамм и перечень включаемых в него характеристик приведены в прилож.1;
2.4.5) должны принадлежать к видам, имеющим документированную историю применения в пищу человеку, не должны обладать факторами патогенности, токсигенности и не вызывать заболеваний у людей и теплокровных животных;
2.4.6) должны иметь изученный профиль антибиотикорезистентности в отношении современных применяемых в медицине антибиотиков и не обладать антибиотикорезистентностью трансмиссивного типа;
2.4.7) должны иметь стабильные фенотипические, генотипические и технологические характеристики; иметь изученный профиль внехромосомных элементов (плазмид, транспозонов, бактериофагов и др.), при наличии внехромосомных элементов их функциональная роль должна быть охарактеризована и доказана неспособность к генному трансферу;
2.4.8) не должны обладать способностью к транслокации в лимфоузлы, паренхиматозные органы, кровь у человека и теплокровных животных, обладающих иммунодефицитностью;
2.4.9) не должны обладать способностью к иммуносупрессии или избыточной иммуностимуляции, а также генерации провоспалительного эффекта in vitro и in vivo;
2.4.10) не должны обладать способностью образовывать новые метаболические продукты или избыток известных продуктов в количествах, способных вызывать побочные эффекты;
2.4.11) не должны ингибировать рост представителей нормальной резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и теплокровных животных.
2.5. Изучение штаммов по показателям, указанным в п.п.2.4.5-2.4.11, характеризующим их безопасность, проводится путем тестирования in vitro и в экспериментах in vivo (на моделях конвенциональных линейных лабораторных животных обоего пола, обычно применяемых в нутрициологии - мышах, крысах, морских свинках, кроликах, с пероральным введением стандартных и аггравированных доз (до 10 КОЕ и более в 1 г инокулята, но не менее 10
КОЕ на животное).
В необходимых случаях могут быть использованы животные-гнотобионты.
2.6. В случае использования генно-инженерно-модифицированных пробиотических штаммов оценка их безопасности проводится в соответствии с требованиями, включенными в МУ 2.3.2.1830-04 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов" и СанПиН 2.3.2.2340-08 "Дополнения и изменения 6 к СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
2.7. Для штаммов зарубежного производства, впервые ввозимых на территорию Российской Федерации, в т.ч. в составе заквасок, пробиотических пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище с живой микрофлорой, необходимо документальное подтверждение разрешения их использования в пищевой промышленности и/или в свободной продаже населению, со стороны компетентных органов страны-изготовителя.
2.8. Потенциальные пробиотических штаммы должны быть охарактеризованы на наличие у них функциональных (пробиотических) свойств. Тестирование функциональных свойств должно совмещать скрининг in vitro с экспериментальной оценкой in vivo на животных, указанных в п.2.5; в необходимых случаях должны предусматриваться клинические испытания выработанных с включением штаммов опытно-промышленных образцов пробиотических продуктов и БАД к пище.
2.8.1. У всех штаммов должна быть изучена выживаемость в проксимальных отделах ЖКТ и пролиферация в толстом кишечнике, устойчивость к действию кислотности желудка, желчи, адгезия к эпителиальным клеткам человека и клеточным культурам, антагонистическая активность против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов-возбудителей острых кишечных инфекций и других инфекций с пищевым путем передачи, способность снижать их адгезию в кишечнике, способность к гидролизу желчных кислот.
2.8.2. В необходимых случаях штаммы должны быть охарактеризованы на способность к продукции биологически активных веществ и других факторов, обусловливающих пробиотический эффект (иммуно-пептидов, антимикробных веществ, в т.ч. бактериоцинов, органических кислот, в т.ч. короткоцепочечных жирных кислот, экзополисахаридов, профиль взаимодействия с клетками иммунной системы и модуляции цитокинов, расщеплению холестерина, антиоксидантной активности и т.д.).
2.9. У потенциальных пробиотических штаммов должны быть охарактеризованы технологические характеристики.
2.9.1. Штаммы, отбираемые для заквасок, бакконцентратов или биомасс, должны сохранять жизнеспособность, генетическую стабильность, функциональные пробиотические характеристики на всех этапах производства, транспортировки и хранения, не сообщать продукту неудовлетворительных вкусов и запахов.
2.9.2. Штаммы, отбираемые для производства мультипробиотических консорциумов, многокомпонентных продуктов, включающих ингредиенты с антимикробной активностью (эфирные масла, лекарственные растения, йод и его соединения, пищевые волокна-адсорбенты и др.) должны быть испытаны на совместимость и хранимоспособность в течение всего срока годности.
2.10. Все исследования и эксперименты на лабораторных животных проводятся по принципам доказательности (наличие контрольных штаммов и групп интактных животных, количество подопытных животных, достаточное для получения статистически значимых результатов).
3. Нормативные ссылки
3.1. Федеральный закон от 02.01.2000 N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов" (с изменениями и дополнениями).
3.2. Федеральный закон от 07.02.1992 N 2300-I "О защите прав потребителей" (с изменениями и дополнениями).
________________
* Утратил силу на основании Федерального закона от 18 декабря 2006 года N 231-ФЗ . - Примечание изготовителя базы данных.
3.4. Федеральный закон от 27.12.2002 N 184-ФЗ "О техническом регулировании" (с изменениями и дополнениями).
3.5. Федеральный закон от 12.06.2008 N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" (с изменениями и дополнениями).
3.6. Федеральный закон от 24.06.2008 N 90-ФЗ "Технический регламент на масложировую продукцию".
3.10. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" (с изменениями и дополнениями).
3.12. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".
4. Термины и определения
Пробиотические микроорганизмы - живые непатогенные, нетоксигенные микроорганизмы, представители защитных групп нормального кишечного микробиоценоза человека и природных симбиотических ассоциаций, благотворно влияющие на организм человека путем улучшения (оптимизации) состава и биологической активности микрофлоры его пищеварительного тракта.
Антагонизм - подавление жизнедеятельности одной микробной культуры (микробной популяции) другой за счет выделения в среду культивирования или совместного обитания веществ (антибиотиков, бактериоцинов, органических и жирных кислот), препятствующих росту или задерживающих размножение.
Симбиоз - благоприятное влияние друг на друга двух и более популяций микроорганизмов при совместном существовании путем улучшения условий своей жизнедеятельности.
Генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы (ГММ) - бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы, вирусы, в которых генетический материал изменен с использованием методов генной инженерии, то есть путем, который не имеет места в природе при размножении и/или при естественных рекомбинациях.
Антибиотикорезистентность трансмиссивная (трансферабельная) - устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, закодированная на внехромосомных генных элементах микробной клетки, наиболее часто встречающийся селективный маркер рекомбинантной ДНК ГММ.
Пробнотические закваски прямого внесения - чистые культуры специально подобранных отдельных штаммов живых пробиотических микроорганизмов, а также смесей штаммов в питательных средах, использованных для их выращивания, либо суспензии вегетативных клеток (в т.ч. концентрированные) без или со средой культивирования, приготовленные на специализированных предприятиях и предназначенные для прямого внесения в подготовленное сырье непосредственно в резервуарах для производства пробиотического продукта. Пробнотические закваски прямого внесения могут выпускаться в сухом виде, в т.ч. лиофилизированном из замороженного состояния, или в жидком, в т.ч. замороженном.
5. Методы исследования таксономической принадлежности пробиотических штаммов
Таксономическая принадлежность штаммов устанавливается на основе полифазного таксономического подхода, использующего комплекс генотипических и ключевых фенотипических тестов, что позволяет с наибольшей степенью точности установить принадлежность микроорганизмов к таксону на уровне вида и штамма.
Разработчиком (поставщиком) должны быть предоставлены данные о сравнения фенотипических свойств штамма с характерными фенотипическими свойствами его вида, описанными в определителе Берги (Bergey's manual of systematic bacteriology. Eds. Sneaht P.N.D. et al. Baltimore; Williams and Wilkins, 1986, v.2).
Исследования проводятся при использовании контрольных (референтных) штаммов данного вида из официальных депозитариев.
Результаты тестирования таксономической принадлежности по фенотипическим признакам одновременно могут использоваться для оценки штаммов в соответствии с требованиями п.2.4 настоящих методических указаний.
