МУК 4.2.2428-08
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод определения бактерий Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) в продуктах для питания детей раннего возраста*
________________
* Измененная редакция, Дополнения и изменения N 4.2.3144-13.
Дата введения 2008-12-15
1. РАЗРАБОТАНЫ Государственным учреждением "Научно-исследовательский институт питания" Российской Академии медицинских наук (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, И.Я.Конь, Н.Р.Ефимочкина, И.Б.Быкова, С.Ю.Батищева).
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.
4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 15 декабря 2008 г.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ
ВНЕСЕНЫ Дополнения и изменения, утвержденные 26.11.2013 N 4.2.3144-13
Дополнения и изменения внесены изготовителем базы данных по тексту М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2014 год
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) - возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста, при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.
(Измененная редакция, Дополнения и изменения N 4.2.3144-13).
1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1.3. Контролю на наличие бактерий Е. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на наличие патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, не были выявлены облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры.
1.4. Необходимость контроля указанных групп продукции на наличие Е. sakazakii обусловлена регистрацией в последние годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей I года жизни, в первую очередь недоношенных, новорождённых с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей, контаминированных Е. sakazakii, в т.ч. при очень низких уровнях возбудителя (1-10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь Е. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта.
1.5. Предлагаемый метод определения бактерий Е. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе. Настоящие методические указания также предусматривают определение количества Е. sakazakii в пищевых продуктах для детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ).
1.6. Обнаружение Е. sakazakii в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных для детей 1 года жизни, или в 300 г сухих молочных смесей или специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев, должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.
1.7. Методические указания носят рекомендательный характер.
(Введен дополнительно, Дополнения и изменения N 4.2.3144-13).
2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры.
Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.
Таблица 1
Схема исследования сухих детских смесей на наличие Cronobacter spp.
Этап | Продолжительность инкубации, ч | Температура |
1. Подготовка реактивов и материалов | ||
2. Растворение навесок продукта в забуференной пептонной воде (ЗПВ) в соотношении 1:9 (при необходимости определения количества - навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы или пробирки с ЗПВ каждая), смешивание и инкубация | 18±2 | 37°С |
3. Посев 0,1 см проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae и инкубация | 24±2 | 44°С |
4. Пересев 0,1 мл проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. (ESIA™) или фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar) | 24±2 | 44°С |
5. Отбор 5 подозрительных на Cronobacter spp. колоний с поверхности хромогенного ESIA-arapa, отбор всех типов колоний с поверхности фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar); пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация | 48±2 | 25°С |
6. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности по биохимическим тестам идентификации | ||
7. Интерпретация результатов. |
2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к Е. sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20Е, Rapid 20Е, ID 32Е (ф. "БиоМерье", Франция) и др.
Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл.2.
Таблица 2
Биохимическая дифференциация Cronobacter spp.
Тест или субстрат | Реакции | ||
Е. sakazakii (Cronobacter spp.) | Е. cloacae | Р. agglomerans | |
Желтый пигмент при 25°С | + | - | (+) |
D-сорбит | - | + | (+) |
-глюкозидаза | + | (-) | - |
Разжижение желатины (22°С) | - | - | + |
Оксидаза | - | - | - |
Лизиндекарбоксилаза | - | - | - |
Аргининдигидролаза | + | + | - |
Орнитиндекарбоксилаза | + | + | (-) |
Утилизация цитратов | + | + | + |
Реакция Фогес-Проскауэра | + | + | (+) |
Индол | - | - | (-) |
Глюкоза | + | + | + |
Маннит | + | + | + |
Лактоза | + | + | (+) |
Сахароза | + | + | (+) |
L-рамноза | + | + | (+) |
D-мелибиоза | + | + | + |
Амигдалин | + | - | (-) |
Подвижность | + | + | (+) |
Мукоидный рост | + | + | + |
|
Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются:
способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25°С;
наличие -глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-глюкопиранозид;
отсутствие способности к ферментации D-сорбита.
Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест разжижения желатины.
Раздел 2 (Измененная редакция, Дополнения и изменения N 4.2.3144-13).
Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН ±0,01 | ||
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160±5) °С | ТУ 64-1-28-70-76* | |
________________ * ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной ±1 °С | ТУ 64-1-1382-83 | |
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной ±1 °С | ТУ 64-1-1382-83 | |
Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г | ||
_______________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 53228-2008. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС | ||
______________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 3-3.404-83, ТУ 3-3.154-80, ТУ 3-3.190-80, ТУ 3-3.193-80, ТУ 3-3.986-81, являющиеся авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные | ГОСТ 19569-89Е* | |
_______________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 51935-2002. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с | ||
Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2", "Стомайкер" или других наименований Гомогенизатор типа "вортекс" | AES Lab., Cat N AESAP 1066* | |
Микропипетки на 200-1000 мкл | ВIOHIТ, Cat. N 720040 или "Ленпипет" | |
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов | ТУ-16-535-84 | |
Холодильник бытовой электрический | ||
Пинцет медицинский | ||
Ножницы медицинские | ||
_______________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 21239-93. - Примечание изготовителя базы данных. | ||
Скальпель хирургический, 15 см | ||
Часы механические сигнальные | ||
Электроплитка | ||
Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания) | ТУ 64-1-2451-78 |