МР 01.018-07

Методика определения токсичности химических веществ,
 полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм"

РАЗРАБОТАНЫ: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Севостьянова Е.М.), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (Данилов B.C.), ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В., Ластенко Л.С., Федосеева).

С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации "Определение интегральной токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста" от 8 июня 2000 г. МР N 11-131-09

УТВЕРЖДЕНЫ: Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И. Верещагиным 15 июня 2007 г.

1. Назначение и область применения

Настоящий документ устанавливает методику определения токсичности отдельных химических соединений, токсичности и соответствие качества различных материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции, материалы, применяемые в водоснабжении и в качестве материалов, контактирующих с пищевыми продуктами. Тест-система представлена биосенсорами серии "Эколюм" и измерительным прибором серии "Биотокс-10".

Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации и специальных служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.

Результаты исследования качества материалов и изделий учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного отрицательного влияния на здоровье человека и прогнозе степени их опасности для населения.

2.*Нормативные ссылки

1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.

2. СанПиН 42-123-4240-86* "Допустимые количества миграции химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми средами и методы их определения"

______________

* На территории Российской Федерации действуют ГН 2.3.3.972-00, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

3. СанПиН 2.1.2.729-99 "Полимерные и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции. Гигиенические требования безопасности".

1.* Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.

2.* СанПиН 42-123-4240-86 "Допустимые количества миграции химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми средами и методы их определения"

3.* СанПиН 2.1.2.729-99 "Полимерные и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции. Гигиенические требования безопасности".

4. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

5. ГН 2.3.3.972-00 "Предельно допустимые количества химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми продуктами".    

 _______________

     * Вероятно ошибка оригинала. Пункты приводятся повторно. - Примечание изготовителя базы данных.

3. Термины и определения

Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в объекты окружающей среды.

Химическое загрязнение объектов окружающей среды - изменение химического состава объектов окружающей среды (в том числе материалов и изделий), возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение их качества и возможную опасность для здоровья населения.

Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество материалов и изделий, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности материалов и изделий при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности образца. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

4. Принцип методики

В качестве тест-объекта используются препараты лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.

Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в анализируемой пробе воды по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

5. Количественная оценка параметров тест-реакции

Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30 минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.

Индекс токсичности "", равный отношению , где и соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биотестом.

Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения и , позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слаботоксического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильнотоксический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).

ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечение биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.

Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция () представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой , где и соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График -функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет представлять величины для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.

Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:

- допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе меньше величины ЕС20;

- образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;

-высокая токсичность образца: индекс токсичности равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) равен или больше величины ЕС50.

6. Оборудование, материалы, реактивы

1 Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.

2. Прибор серии "Биотокс-10", сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31.003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;

3. Весы лабораторные общего назначения, ГОСТ 24104;

4. pH-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;

5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы - 0,5 °С, ГОСТ 215;

6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;

7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (+2+4 °С);

8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;

9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;

10. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;

11. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02 - 0,5 мл±1,0%;

12.Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;

13.Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;

14. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;