МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Определение токсичности химических соединений, полимеров,
материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста
1. РАЗРАБОТАНЫ: Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (Скачков В.Б., Брагина И.В., Ластенко Н.С), НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Калинина Н.В.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов В.С., Зарубина А.П., Соловьева Л.Н.).
2. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России А.А.Монисовым 08 июня 2000 г. МР N 11-1/131-09
1. Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает методику определения токсичности отдельных химических соединений, различных материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции, материалы, применяемые в водоснабжении и в качестве материалов, контактирующих с пищевыми продуктами, с использованием в качестве тест-объекта люминесцентных микроорганизмов "Эколюм" и измерительного прибора серии "Биотокс".
Документ предназначен для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и специальных служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Результаты исследования качества материалов и изделий учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного отрицательного влияния на здоровье человека и прогнозе степени их опасности для населения.
2. Нормативные ссылки
1. Закон Российской Федерации "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан".
2. Закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
3. "Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июня 1998 г. N 680.
4. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. N 625 с изменениями и дополнениями от 30 июня 1998 г. N 680.
5. Порядок разработки, экспертизы, утверждения, издания и распространения нормативных и методических документов системы санитарно-эпидемиологического нормирования. Р 1.1.001-1.1.005-96.
________________
* Действуют СанПиН 2.3.2.1078-01 "Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов". Здесь и далее по тексту. - Примечание "КОДЕКС".
7. Методические указания по осуществлению государственного санитарного надзора за устройством и содержание жилых зданий N 2295-81, утвержденные МЗ СССР 24.02.81. М., 1981.
4.* Термины и определения
_________________
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание "КОДЕКС".
Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в объекты окружающей среды.
Химическое загрязнение объектов окружающей среды - изменение химического состава объектов окружающей среды (в том числе материалов и изделий), возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение их качества и возможную опасность для здоровья населения.
Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество материалов и изделий, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности материалов и изделий при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.
Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности образца. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
4. Принцип методики
Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
Острое токсическое действие исследуемой пробы на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-ти минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности "", равной отношению
,
где и
соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с тест-объектом.
Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности;
1) допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20;
2) образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50;
3) образец сильно токсичен: индекс токсичности равен или более 50.
5. Характеристики погрешности
Метрологические характеристики биотеста в соответствии с аттестацией 4/7-93, проведенной органами Госстандарта: сходимость результатов определения тест-параметра - 5%, воспроизводимость результатов определения тест-параметра - 5%.
6. Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс"
Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Производится согласно ТУ 6-09-20-236-93. Биосенсор, содержащийся при температуре 2-4 °С, имеет гарантированный срок хранения не менее 6 месяцев.
Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.
Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса токсичности, вычисление стандартного отклонения показателя токсичности, определения величин ЕС20 и ЕС50 - пороговых значений допустимой степени и острой степени токсичности образца, исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерная обработка данных, наличие сигнала для оператора при превышения пробой допустимого уровня токсичности.
7. Оборудование, материалы, реактивы
Прибор серии "Биотокс", производимый согласно ТУ-446-У-028-00-ОТУ, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;
весы лабораторные общего назначения ГОСТ 24104;
