МУК 4.1/4.2.588-96

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ВВОДИМЫХ ЛЮДЯМ

TESTING OF INJECTABLE MEDICAL IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS

Дата введения с момента утверждения

УТВЕРЖДАЮ              

Первый заместитель Председателя Госкомсанэпиднадзора России, Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации С.В.Семенов 31 октября 1996 года             

1. Область применения

Настоящие Методические указания предназначены для работников предприятий, осуществляющих контроль качества вакцин, анатоксинов, сывороток, иммуноглобулинов, аллергенов, эубиотиков и других иммунобиологических препаратов, вводимых людям.

Все положения настоящего документа распространяются на предприятия, производящие МИБП, независимо от их ведомственной принадлежности и формы собственности.

2. Нормативные ссылки

2.1. Вакцинопрофилактика СП 3.1.1.95*.

_______________
     * Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

2.2. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 13.01.83 N 31*.

________________

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

2.3. Производство и контроль медицинских иммунобиологических препаратов для обеспечения их качества*.

________________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует СП 3.3.2.1288-03. - Примечание изготовителя базы данных.

3. Общие положения

3.1. Целью введения настоящих Методических указаний является регламентация методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов на их соответствие требованиям нормативной технической документации и, прежде всего, Фармакопейной статьи (Временной фармакопейной статьи).

3.2. Задачей проведения общих методов контроля является преимущественно установление безопасности МИБП, вводимых людям.

3.3. Методические указания содержат описание общих методов контроля МИБП, вводимых людям. Особенности контроля качества МИБП, не охватываемые настоящим документом, описаны в нормативно-технической документации на эти препараты.

4. Термины и определения

4.1. Биологические термины и определения

4.1.1. Медицинские иммунобиологические препараты, вводимые людям, - вакцины, анатоксины, иммуноглобулины, сыворотки, аллергены, эубиотики и другие лекарственные средства, предназначенные для иммунопрофилактики, иммунотерапии и иммунодиагностики инфекционных заболеваний и аллергических состояний.

4.1.2. Качество МИБП - совокупность свойств продукции, обусловливающих ее способность удовлетворять определенные потребности в соответствии с ее назначением.

4.1.3. Готовая серия препарата - совокупность емкостей, полученных из одного готового к розливу полуфабриката, разлитых из одной емкости.

4.2. Химические термины и определения

4.2.1. Концентрация. Концентрация растворов в весобъемных процентах. Например, для приготовления 10%-ного раствора следует брать 10 г вещества и растворителя для получения 100 мл раствора.

4.2.2. Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано: "точная навеска", то навеску берут с точностью до 0,01 г.

4.2.3. Постоянная масса. Разница в массе между последовательными взвешиваниями, не превышающая 0,0005 г.

4.2.4. Растворитель - дистиллированная вода, если нет других указаний.

4.2.5. Оценка результатов. Расчет результатов на основании 2 параллельных определений.

4.2.6. Квалификация реактивов. Для анализа используют реактивы квалификации х.ч. и ч.д.а.

4.2.7. Моющее средство. Хромовая смесь для обработки посуды (5%-ный раствор калия дихромата в концентрированной серной кислоте).

4.2.8. Контрольный опыт. Определение, проводимое с теми же количествами реактивов в тех же условиях, но без испытуемого препарата. Вместо испытуемого препарата используется растворитель.

4.2.9. Хранение растворов. Хранение растворов реактивов при температуре 18-20 °С в течение 6 мес, если нет изменений их физических свойств.

4.2.10. Спирт - этиловый ректификованный, содержащий 96% спирта (по массе).

5. Определение электрофоретической чистоты и молекулярных масс генно-инженерных препаратов

Метод используется для анализа генно-инженерных продуктов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов, предназначенных для введения людям.

Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы генно-инженерных продуктов применяют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях с последующей окраской геля как Кумасси ярко-голубым R-250, так и нитратом серебра. Образование комплекса SDS с белком устраняет различия между белками, связанные с их зарядом, и переводит молекулы белков в конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы белка. При соблюдении этих условий подвижность белков отражает их молекулярные массы.

Испытания проводят на полуфабрикате препарата (очищенного продукта) до добавления каких-либо стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы.

Электрофорез проводят в редуцирующих (в присутствии бета-меркаптоэтанола) и нередуцирующих (в отсутствии бета-меркаптоэтанола) условиях. Определение молекулярных масс генно-инженерных белков проводят при окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 с нагрузкой на лунку 10 мкг, а определение чистоты - при нагрузке 40 мкг.

Параллельно, для оценки содержания примесей как белковой, так и небелковой природы, проводят электрофорез в редуцирующих условиях при окрашивании нитратом серебра с нагрузкой на лунку 2-5 мкг белка.

Методика определения. Полимеризацию геля ведут в ячейке, образованной стеклами и прокладками, определяющими размер и толщину геля. Сборку ячейки проводят в соответствии с инструкцией по работе с конкретным типом прибора для вертикального электрофореза. Описание метода проводится на примере аппарата "Протеан 11" фирмы "Био-Рад", США. Для данного прибора размеры стекол ячейки составляют: внешнее стекло - 22х20 см, внутреннее стекло - 20х20 см. Размеры прокладок: длина - 20 см, ширина - 18 см, толщина - 0,75-1,0 мм. При наличии приборов с другими характеристиками необходимо внести соответствующие коррективы в постановку испытаний.

Проведение электрофореза

Нижнюю камеру аппарата для электрофореза заполняют электродным буферным раствором и вставляют в нее электрофоретическую ячейку с гелем. Верхний резервуар заполняют электродным буферным раствором, удаляют из лунок пузырьки воздуха. Под слой буферного раствора в лунку вносят исследуемые образцы. Электрофорез проводят при температуре 10-14 °С в режиме постоянного тока. При прохождении фронта красителя через концентрирующий гель сила тока составляет 10-12,5 мА на 1 см сечения геля (20-25 мА/гель). После вхождения фронта красителя в нижний разделяющий слой на 5-7 мм силу тока увеличивают до 20 мА на 1 см сечения геля (40 мА/гель). После продвижения красителя на 14 см от нижнего края концентрирующего геля ток отключают, отделяют гель от стекол ячейки и переносят в кювету для окрашивания. Для того чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель полностью не обрезают, оставляя 0,5-10 мм. В случае необходимости можно обрезать часть нижнего геля по фронту красителя. Нанесение образцов на гель проводят в следующем порядке. В лунки 1 и 10 вносят соответствующий (с бета-меркаптоэтанолом или без) буфер для приготовления образцов, разбавленный деионизованной водой в 4 раза. В лунки 2 и 9 вносят по 7 мкл смеси стандартных белков, например фирмы "Фармация", Швеция. В остальные лунки вносят исследуемые образцы. При окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 вносят попарно такие объемы образца, чтобы количество белка в них составляло соответственно 10 и 40 мкг. При окрашивании геля нитратом серебра, в зависимости от препарата, в лунки вносят 2-5 мкг белка. Параллельно в одну из лунок вносят 0,002-0,01 мкг белка (в зависимости от чувствительности выявления минимальных количеств белка в данных условиях).

Окрашивание геля

1. Окрашивание Кумасси ярко-голубым R-250. Гель фиксируют 1 ч в фиксирующем растворе, после чего окрашивают в течение 16 ч. Затем окрашивающий раствор сливают, гель 2-3 раза споласкивают обесцвечивающим раствором и помещают в аппарат для обесцвечивания, заполненный обесцвечивающим раствором. Обесцвечивание проводят в течение 15 мин при напряжении 24 В. Гель вынимают из аппарата для обесцвечивания и споласкивают раствором для обесцвечивания и деионизованной водой.

2. Окрашивание нитратом серебра. Окрашивание геля нитратом серебра проводят с использованием коммерческого набора реагентов (фирмы "Био-Рад", США, или других) согласно прилагаемой инструкции. Следует обратить внимание на время выдерживания геля в проявляющем растворе. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в лунке с минимальным количеством препарата (например, 0,005 мкг).

Высушивание геля

В кювету наливают 0,5 л раствора для высушивания геля, помещают лист целлофановой диализной мембраны, например фирмы "Фармация", Швеция. На нем размещают гель и сверху накрывают вторым листом целлофановой диализной мембраны. Кювету закрывают крышкой и помещают на качалку. При покачивании гель выдерживают 20-30 минут. Стекло смачивают раствором для высушивания геля и на него плотно, без пузырьков воздуха, натягивают смоченный лист целлофановой диализной мембраны, на нее помещают гель. Сверху плотно, без пузырьков воздуха прикрывают вторым смоченным листом целлофановой диализной мембраны. Закрепляют и оставляют на столе при комнатной температуре не менее чем на 18-20 ч. Высушенный гель снимают со стекла вместе с целлофановой диализной мембраной и аккуратно обрезают. Гель готов для проведения денситометрии и оценки результатов.

Денситометрия окрашенного геля

Проводится денситометром фирмы ЛКБ, Швеция, или другим не меньшей чувствительности. Денситометрию проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации данного прибора от верхнего края нижнего разделяющего геля по пути пробега белков в данной лунке. В зависимости от конструкции аппарата может проводиться денситометрия влажного и высушенного геля. Для учета фона геля может денситометрироваться дорожка с нанесенным буферным раствором для образцов, разбавленным деионизованной водой в 4 раза (в нашем примере дорожки 1 и 10). Площадь интегрирования самого большого зарегистрированного пика является нижним пределом для денситометрии анализируемых образцов. Однако при этом на дорожках с буферным раствором не должны обнаруживаться окрашенные полосы.

Определение молекулярных масс генно-инженерных белков

Молекулярные массы мономеров и олигомеров исследуемого продукта определяют на электрофореграмме, полученной после окрашивания Кумасси ярко-голубым R-250 в редуцирующих условиях при нагрузке на лунку 10 мкг белка. Для этого измеряют расстояние от верхнего края нижнего разделяющего геля до белковых зон стандартных белков (дорожки 2 и 9) - величина . Таким же образом определяют расстояние пробега красителя (величина ). Для каждого стандартного белка определяют коэффициент подвижности по формуле:

.

Строят график зависимости стандартного белка от логарифма молекулярной массы стандартного белка. Затем определяют для каждой белковой зоны исследуемого образца и по калибровочному графику определяют логарифмы молекулярной массы, из которых рассчитывают молекулярную массу соответствующих белков.

Оценка результатов электрофореза

После завершения электрофореза исследуемые образцы не должны содержать неидентифицированных продуктов или их агрегатов в лунках гребенки геля или на границе при вхождении в гель. Для количественной оценки процента содержания целевого белка, его олигомеров, фрагментов и примесей проводят сканирование геля при помощи денситометра. Содержание генно-инженерного продукта в редуцирующих условиях при окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 должно быть не менее 95%. Требования к другим параметрам (относительное содержание мономеров, олигомеров, фрагментов, белковых и небелковых примесей, чистота и картина дорожки на электрофореграмме в нередуцирующих условиях и при окрашивании нитратом серебра) определяются характеристиками и назначением конкретных исследуемых препаратов и указываются в частных фармакопейных статьях.

Примечания.

I. Приготовление нижнего разделяющего геля

1. Для приготовления 15%-ного геля в химический стакан, емкостью 100 мл, наливают 25 мл 30%-ного раствора акриламида/бисакриламида, 12,5 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1,5 моль/л, рН 8,8, 11,75 мл деионизованной воды и 500 мкл 10%-ного раствора SDS. Полученный раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору прибавляют 250 мкл 10%-ного раствора ПСА и 25 мкл TEMED, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.

2. Для приготовления 12%-ного геля в химический стакан, емкостью 100 мл, наливают 20 мл 30%-ного раствора акриламида/бисакриламида, 12,5 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1,5 моль/л, рН 8,8, 16,75 мл деионизованной воды и 500 мкл 10%-ного раствора SDS. Полученный раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору добавляют 250 мкл 10%-ного раствора ПСА и 25 мкл TEMED, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.

Мениск раствора в ячейке должен находиться на расстоянии 3-4 см от верхнего края внутреннего стекла. На раствор в ячейке наслаивают 1,0 мл деионизованной воды так, чтобы гель и вода не перемешивались. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин при температуре 18-20 °С. Сначала граница между гелем и водой размывается, а затем становится резкой. Это является моментом окончания полимеризации.

II. Приготовление верхнего концентрирующего геля

После окончания полимеризации нижнего разделяющего геля воду сливают, поверхность геля тщательно подсушивают с помощью фильтровальной бумаги и заливают в ячейку 4%-ный раствор верхнего концентрирующего геля. Для его приготовления в химический стакан, вместимостью 50 мл, наливают 1,3 мл 30%-ного раствора акриламида/бисакриламида, 2,5 мл раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л, рН 6,8, 6,1 мл деионизованной воды и 100 мкл 10%-ного раствора SDS. Раствор дегазируют под вакуумом в колбе Бунзена 15 мин. К дегазированному раствору добавляют 50 мкл 10%-ного раствора ПСА, 10 мкл TEMED, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку. После этого в ячейку вставляют гребенку с необходимым (например, десятью) количеством зубьев и толщиной, равной толщине прокладки. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин при температуре 18-20 °С. После завершения полимеризации гребенку удаляют и промывают образовавшиеся лунки 1 раз деионизованной водой и 10 раз электродным буферным раствором.

III. Приготовление растворов

1. Электродный буферный раствор (5х) рН 8,3

45,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 216,0 г глицина, 15,0 г SDS помещают в градуированный стакан, прибавляют 2000,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем деионизованной водой до 3000,0 мл, фильтруют, измеряют рН, который должен быть в пределах 8,3. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.

2. Электродный буферный раствор рН 8,3

К 600,0 мл электродного буферного раствора (5х) прибавляют 2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают.

3. 30%-ный раствор акриламида/бисакриламида

29,20 г акриламида и 0,80 г бисакриламида помещают в градуированный химический стакан и прибавляют 80,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в темной посуде при 4-6 °С не более месяца.

4. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1,5 моль/л, рН 8,8